Thèse Caractérisation des Mécanismes de Résistance dans les Cancers Récidivants à l'Aide de Modèles Dérivés de Patients Pdto et de Criblages Crispr en Vue d'Identifier de Nouvelles Cibles Thérapeu H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health École doctorale : Cancérologie : Biologie - Médecine - Santé Laboratoire de recherche : Dynamique des Cellules Tumorales Direction de la thèse : Kristine SCHAUER ORCID 0000000261028790 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-09-30T23:59:59 L'oncologie de précision a considérablement élargi l'identification d'altérations génomiques actionnables dans les tumeurs solides. Cependant, la traduction de ces découvertes en bénéfices cliniques durables reste limitée. De nombreuses altérations génétiques considérées comme « actionnables » ne correspondent pas nécessairement à de véritables dépendances oncogéniques, tandis que les mécanismes de résistance aux traitements émergent souvent par des processus génétiques, épigénétiques et adaptatifs complexes qui ne peuvent être appréhendés par le seul séquençage. Le développement d'approches fonctionnelles est donc indispensable pour mieux caractériser les vulnérabilités tumorales et orienter les stratégies thérapeutiques.

Ce projet vise à développer une plateforme intégrée d'oncologie de précision fonctionnelle combinant des organoïdes tumoraux dérivés de patients (PDTO) et des criblages CRISPR/Cas9 afin d'identifier les mécanismes de résistance aux traitements et de nouvelles cibles thérapeutiques dans les cancers récidivants. Les PDTO conservent les principales caractéristiques histologiques, moléculaires et fonctionnelles des tumeurs d'origine, constituant ainsi des modèles pertinents pour l'étude de la réponse aux traitements. Nous faisons l'hypothèse que l'association de modèles PDTO biologiquement pertinents et de criblages CRISPR à grande échelle permettra de révéler les gènes et voies de signalisation responsables de la résistance thérapeutique.

Le premier objectif consistera à constituer et caractériser une biobanque diversifiée de PDTO issus de différents types de cancers prélevés avant traitement, après traitement et, lorsque cela sera possible, au moment de la rechute. Les conditions de culture seront optimisées en évaluant différents milieux, matrices extracellulaires et systèmes de culture avancés, notamment des dispositifs microfluidiques et des configurations à interface air-liquide. Une caractérisation phénotypique et moléculaire approfondie permettra d'évaluer la prolifération, la différenciation, le métabolisme, l'organisation des organites et la sensibilité aux traitements. Des approches d'imagerie dynamique et de tomographie permettront en outre de suivre l'évolution des tumoroïdes en temps réel.

Le deuxième objectif sera de mettre en place des protocoles de criblage CRISPR adaptés à chaque modèle de PDTO. Des bibliothèques de guides ciblant notamment des voies impliquées dans la résistance thérapeutique seront développées. Après séquençage à haut débit, les analyses bioinformatiques réalisées avec les outils MAGeCK, MAGeCKFlute, GSEA et Reactome permettront d'identifier les gènes et voies essentiels à la survie tumorale, à la prolifération et à la résistance aux traitements.

Enfin, les mécanismes de résistance et les vulnérabilités identifiés seront validés dans les modèles PDTO à l'aide d'approches fonctionnelles intégrant imagerie, mesures de viabilité, analyses métaboliques et plateformes avancées de culture 3D. Les cibles les plus prometteuses seront évaluées dans une perspective translationnelle à l'aide d'agents ciblés, d'anticorps ou de conjugués anticorps-médicament.

En combinant modélisation tumorale avancée, génomique fonctionnelle et bioinformatique, ce projet vise à établir une cartographie fonctionnelle des vulnérabilités tumorales et des mécanismes de résistance à l'échelle du patient, contribuant ainsi au développement de stratégies de médecine de précision plus efficaces pour les cancers récidivants. The development of precision oncology has enabled the identification of molecular alterations that can guide targeted therapy across multiple solid tumors. Over the past decade, the proportion of patients with potentially actionable genomic alterations has increased substantially, and a growing number of targeted therapies are now approved or available through clinical trials.

However, the clinical impact of genomics-driven precision oncology remains limited by several biological and operational challenges. In many patients, genomic alterations classified as actionable do not necessarily represent true oncogenic drivers. Conversely, tumors may harbor functional dependencies that are not easily inferred from DNA sequencing alone. In addition, both primary and acquired resistance to targeted therapies frequently arises through complex genetic, epigenetic and adaptive mechanisms.

Our aim is to move beyond basic genomics and develop functional assays capable of improving treatment orientation.

Patient-derived tumor organoids (PDTO) are three-dimensional tumor models established from fresh patient samples. They can preserve key histological, molecular and functional features of the original tumor and therefore represent a promising platform for individualized drug testing and translational oncology. In parallel, pooled CRISPR/Cas9 screening allows systematic perturbation of genes to identify those required for tumor cell survival, proliferation, resistance or adaptation. Combining PDTOs with CRISPR screening offers the opportunity to generate a functional map of tumor vulnerabilities at the individual patient level. 1) Generate and characterize PDTOs from various types of cancer before and after treatment and whenever possible after recurrence.
2) Set-up specific CRISPR screen protocol for each model, from exploratory screens to pathway-focused smaller size screens.
3) Characterize resistance mechanisms and validate new therapeutic targets identified by CRISPR screening 1) Generate and characterize PDTOs from various types of cancer before and after treatment and whenever possible after recurrence.

1a. PDTO bio-bank. OrganoScreen has already generated PDTOs from triple-negative breast cancer carcinomas, prostate and colon carcinomas, sarcomas, testicular carcinomas. Other tumor types will be included. Patients will be selected from several existing clinical trials and programs (Organoidogram, OASIS...) to build Gustave Roussy biobank including PDTO models from early and later established passages.

1b. PDTO generation. Compare and optimize organ-specific media (enriched home-made media, commercial media) and extracellular matrix (EHS-derived matrix, synthetic functionalized ECM, decellularized matrix) to obtain cell proliferation at least comparable with tumor proliferation index. Monitor tumor cell proliferation, differentiation, metabolism, organite organization, cellular configuration (as compared to HES primary tumor slices). Test microfluidic models, micropatterned plates, hypoxic conditions, ALI configuration.
Whenever possible, some primary tumor cells will be frozen for further testing and reference.

1c- Characterization of PDTO cellular and molecular profiles. PDTO from original or early stages (P0-P1) will be compared with later passage stages (P > 5) for proliferation, differentiation, organite localization and drug resistance. Both will also be compared to the original tumor and recurrent tumor for clinical features (proliferation, differentiation, organization).

1d- Specifically set up tomography method to analyze dynamically live cell phenotype modulation and organite dynamics. Goal will be to monitor tumoroid composition and changes (apoptosis, proliferation) along time.

2) Set-up specific CRISPR screen protocol for each model, from exploratory screens to pathway-focused smaller size screens.

2a- Design appropriate guide libraries for CRISPR screen, including known resistance-linked pathways (antigen-specific, intra-cellular trafficking, cell survival).

2b- Perform CRISPR-based screening experiment. To ensure robust and interpretable pooled CRISPR screening results, each PDTO model will be expanded to achieve approximately 14 population doublings, with growth kinetics assessed to define the optimal screening duration. Cell numbers will be adjusted according to library size to maintain adequate representation and coverage. Viral titration experiments will be performed to establish a low MOI, ensuring the integration of a single gRNA per cell and minimizing confounding effects from multiple gene knockouts.

2c. Bioinformatic Analysis. Following completion of the CRISPR screen, NGS-based quantification of gRNA abundance will be performed on baseline and endpoint samples. Comparative analyses will be conducted to identify significantly depleted or enriched sgRNAs and their corresponding target genes, thereby enabling the prioritization of putative therapeutic vulnerabilities for further experimental validation. Data processing and hit calling will be performed using the MAGeCK/MAGeCK-VISPR framework, including sgRNA counting, quality control, normalization, and statistical identification of positively and negatively selected genes. Candidate hits will then be subjected to pathway enrichment and functional annotation analyses using MAGeCKFlute, Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), and Reactome, providing mechanistic insights into the molecular pathways underlying tumor cell fitness and therapeutic response.


3) Characterize resistance mechanisms and validate new therapeutic targets identified by CRISPR screening

Characterize resistance mechanisms by validating candidate gene and pathways using PDTO-based strategies monitored by brightfield microscopy, functional markers for proliferation, metabolism and differentiation, organite response, fluorescent life/death markers and tomography. PDTO derived from untreated patients will be compared to PDTO from resistant tumors.

After characterization, candidate genes and pathways will be scrutinized to identify new potential therapeutic tactics (antibodies, drugs, ADC...). Reagents will be tested in PDTOs from drug-resistant tumors and potentially from PDTO displaying drug-resistance from ex vivo longer-term cultures. PDTO response will be monitored using and comparing several methods: end-of-experiment commercial kits (CellTiter-glo...), life/death fluorescent markers, live cell imaging and tomography, testing several methods for sensitivity: Micropatterned plates (Alveole type), microdrop chips (Okomera) or microfluidic chips for longer term follow-up (Cubix).

La candidate a été identifiée.

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• Bio-informatique