Thèse Utilisation des Hydrophobines dans la Fonctionnalisation et l'Analyse du Flavocytochrome B558 H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Chimie École doctorale : Sciences Chimiques : Molécules, Matériaux, Instrumentation et Biosystèmes Laboratoire de recherche : Institut de Chimie Physique Direction de la thèse : Laura BACIOU ORCID 0000000234014844 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-11-17T23:59:59 En cas d'infection par des pathogènes, les espèces réactives de l'oxygène (ROS) générées par la NADPH oxydase des neutrophiles constituent des armes de destruction massive. Si des niveaux élevés de ROS contribuent à des situations inflammatoires, des niveaux trop faibles dus à un dysfonctionnement de l'enzyme conduisent à une maladie génétique immunitaire appelée la granulomateuse septique chronique (CGD). Les patients atteints de CGD possèdent des neutrophiles avec un système oxydatif défectueux et subissent alors des infections récurrentes voire mortelles. Dans le présent projet nous proposons d'explorer des méthodologies innovantes dans le domaine des protéines membranaires en l'appliquant à la NADPH oxydase. Les objectifs sont de i) stabiliser le coeur catalytique membranaire de la NADPH oxydase pour pouvoir avancer vers des études structurales et fonctionnelles plus poussée ; et ii) d'explorer le potentiel des nanoparticules obtenues à des fins thérapeutiques pour des patients CGD. Les neutrophiles disposent d'un arsenal moléculaire microbicide, constitué notamment par un complexe enzymatique appelé NADPH oxydase qui catalyse massivement la production d'anions superoxyde. Ces molécules sont les précurseurs des espèces réactives de l'oxygène (ou ROS pour reactive oxygen species). Tout défaut de fonctionnement ou d'activation de la NADPH oxydase entraîne une incapacité des phagocytes à détruire les microorganismes internalisés par endocytose, ce qui est observé dans la maladie génétique immunitaire appelée la granulomatose septique chronique (CGD).
L'activité de la NADPH oxydase dépend de l'assemblage au niveau de la membrane plasmique ou de celle des vésicules de phagocytose de deux types de constituants : un cytochrome b membranaire (Cytb558) formé de 2 sous-unités gp91phox (ou NOX2) et p22phox qui possède tous les éléments (hèmes, FAD) pour fonctionner comme une oxydase mais qui a besoin d'être activé par des facteurs protéiques (p47phox, p67phox, p40phox, Rac1/2) présents dans le cytoplasme des neutrophiles au repos. Ainsi, en réponse à un stimulus, c'est la translocation à la membrane plasmique de ces facteurs cytosoliques d'activation et leur ancrage sur le cytochrome b qui conditionnent l'activité de la NADPH oxydase. L'explosion oxydative des neutrophiles est un phénomène transitoire qui ne persiste que quelques minutes et qui ne peut pas être effectué chez les sujets déficients en une NADPH oxydase fonctionnelle.
Plusieurs questions sur des aspects structuraux et fonctionnels de la NADPH oxydase sont encore restées sans réponse jusqu'à nos jour. Le plus grand obstacle est la nature complexe des NADPH oxydases qui associe des interactions protéine-protéine, lipide-protéine à des réactions rédox impliquant des transferts de charges. Le coeur catalytique qui est l'association de deux protéines membranaires présente une instabilité en absence d'environnements natifs. Ce projet permettra de mettre en évidence pour la première fois, la stabilisation de protéines membranaires de la NADPH oxydase par les hydrophobines et de les utiliser pour former des nanocapsules. Les nanoparticules impliquant l'utilisation d'hydrophobines (HFB), protéines ayant des propriétés physico-chimiques particulièrement intéressantes sont connues par leur propriété non-immunogène pour l'organisme humain. Les HFB sont capables de former spontanément des micelles stables. Ces HFB sont déjà utilisées efficacement dans différentes applications biotechnologiques et médicales qui ont donné lieu à différents brevets, comme la stabilisation et l'immobilisation de différentes molécules, l'activation et la diminution de la tension des surfaces. Ces propriétés rendent les HFB des candidates intéressantes pour leurs utilisations potentielles pour former des nanoparticules fonctionnelles avec le Cytb558. Le projet proposé vise à construire des nanoparticules formées par un mélange d'hydrophobines recombinantes et de Cytb558 de neutrophiles et/ou recombinantes qui seront utilisées pour deux applications différentes : la stabilisation du complexe membranaire (gp91phox et p22phox) pour permettre son étude structurale et fonctionnelle ; Et en deuxième lieu pour être utilisées comme véhicules de Cytb558 vers des cellules phagocytaires (système de « Drug Delivery ») in vitro. La thérapie recombinante à base de protéoliposomes est une approche émergente et innovante pour l'administration de protéines membranaires, qui pourrait être un traitement alternatif local et ciblé pour lutter contre les infections pulmonaires chez les patients atteints de CGD. En parallèle, des travaux antérieurs ont montré qu'avec les HFB, on peut former des nanocapsules tout comme les liposomes mais avec une stabilité plus importante. Les hydrophobines (HFB) fongiques sont des protéines amphipathiques uniques qui jouent de multiples rôles dans le cycle de vie des champignons et dans la médiation des interactions entre le champignon et l'hôte. Les HFB de classe II forment des monocouches et peuvent être solubilisées avec des solvants organiques et des détergents.
D'après les données structurales et analytiques, elles peuvent s'organiser sous forme de films ou bien de micelles sur une surface ou en solution, respectivement. Elles peuvent donc changer des surfaces apolaires en surfaces polaires, ce qui leur confère la capacité de fixer des protéines ou des molécules par des interactions. Des techniques de biologie moléculaires et de biochimie seront couplées à des approches biophysiques pour caractériser les hydrophobines de classe II provenant du champignon Sclerotinia sclerotiorum. En Tunisie, les expériences de biologie moléculaire et les optimisations de production seront effectuées alors qu'à l'ICP, le scale-up et les caractérisations se feront dans l'équipe ou sur les plateformes du périmètres de l'Université Paris Saclay.

Le (la) candidat(e) devra avoir un fort intérêt pour la biochimie et/ou la biophysique de protéines.

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