Thèse Impact du Réchauffement Climatique sur la Virulence des Novirhabdovirus Approche Multimodèles pour l'Étude de leur Adaptation Thermique et la Prédiction Épidémique. H/F - Doctorat.Gouv.Fr
- CDD
- Doctorat.Gouv.Fr
Les missions du poste
Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health École doctorale : Structure et Dynamique des Systèmes Vivants Laboratoire de recherche : IERP - Infectiologie Expérimentale Rongeurs et Poissons Direction de la thèse : Christelle LANGEVIN ORCID 0000000260134460 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-09-15T23:59:59 Le réchauffement des eaux impacte l'aquaculture mondiale par la nécessité d'adaptation des espèces et l'émergence de pathogènes soumis à cette pression de sélection. Le projet AquaTherm 2 s'intègre dans un projet plus global (ANR ThermoFish) visant à apporter des éléments de connaissances sur l'impact du réchauffement climatique sur la truite arc-en-ciel et sur deux pathogènes réglementés de cette espèce, le virus de la septicémie hémorragique virale (vSHV) et le virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (vNHI).
Au cours des dernières années, les partenaires du projet (IERP - VIM, INRAE et VIMEP, ANSES) ont développé des outils et technologies innovants et originaux pour mener des recherches sur ces questions scientifiques et ont obtenus des résultats intéressants montrant que les souches de vNHI se répliquant au-delà des températures usuelles de réplication des novirhabdovirus, ont une virulence accrue in vivo en modèle poisson zèbre (signes cliniques, taux de mortalité élevé). Dans cette nouvelle étape, nous étudierons l'impact des températures élevées du point de vue de l'hôte : le poisson zèbre et la truite arc en ciel (performances zootechniques, compétences immunitaires, réponses aux infections par vNHI) par des approches transcriptionnelles et phénotypiques.
L'étude sera également étendue à des souches de terrain de vSHV disponibles au sein de la souchothèque de l'ANSES et à des souches recombinantes thermo-adaptées in vitro par l'équipe de Stéphane Biacchesi et Jean Millet (VIM). Nous estimerons la plasticité génétique et phénotypique de ces souches et mènerons une analyse intégrée (in vitro et in vivo) et multi-espèces (poisson zèbre, truite arc-en-ciel) de caractérisation de la virulence. Les résultats générés, outre le renforcement des collaborations et de la synergie entre les 3 laboratoires partenaires (INRAE et ANSES), contribueront à anticiper l'émergence de souches virales capables de se répliquer à de plus hautes températures, donc sélectionnées par le stress thermique. La santé de deux espèces poissons sera examinée en réponse à ce stress pour modéliser et prédire les conséquences potentielles des augmentations et variations de température (facteurs abiotiques) sur la santé des poissons d'élevage en milieu dulcicole. Nous identifierons des biomarqueurs pertinents des réponses au stress thermique et examinerons les capacités de ces poissons à répondre à un challenge infectieux au regard des modulations probables de leur immunité.
Enjeux scientifiques et socio-économiques auxquels répond le projet
Le changement climatique constitue une menace existentielle sans précédent avec des implications graves pour la quasi-totalité des espèces, des écosystèmes et la biosphère. L'une des principales menaces est l'impact du changement climatique sur la sécurité alimentaire mondiale. Axé sur l'aquaculture, secteur de production ayant le plus fort taux de croissance (~6% par an, FAO 2022), le projet de thèse AquaTherm 2 s'inscrit dans la continuité du projet de thèse AquaTherm (cofinancé par INRAE et ANSES) et du projet de recherche ANR ThermoFish afin d'aborder l'une des préoccupations les plus urgentes auxquelles est confronté ce secteur crucial de la production alimentaire, à savoir : peut-on prédire les impacts de la hausse des températures dans les milieux aquatiques sur les principales maladies infectieuses virales et leurs hôtes piscicoles ?
L'un des principaux défis des prochaines décennies consistera à nourrir plus de 9 milliards d'individus dans un contexte de changement climatique. La consommation mondiale de poisson ne cesse d'augmenter et la demande future ne pourra être satisfaite par la seule pêche de capture. L'aquaculture représente la principale source de produits alimentaires aquatiques (FAO 2022). Environ 94 % de toutes les pêcheries d'eau douce se trouvent dans les pays en développement, fournissant de la nourriture et des moyens de subsistance à des millions de personnes parmi les plus pauvres du monde. Le développement d'une aquaculture durable doit relever plusieurs défis : garantir la santé et le bien-être des animaux, lutter contre les maladies infectieuses émergentes et adapter les pratiques agricoles à la demande sociétale et aux crises environnementales telles que les modifications anthropiques, les polluants et les changements globaux. Par conséquent, le contrôle des agents pathogènes qui affectent les poissons d'aquaculture sans compromettre les engagements environnementaux est une priorité cruciale. Cela nécessite de modifier les pratiques agricoles, de limiter l'utilisation d'antibiotiques et de développer des vaccins efficaces adaptés aux traitements de masse.
État de l'art scientifique - Originalité du projet
L'originalité du projet AquaTherm 2 repose sur la prise en compte de l'impact de l'augmentation des températures des eaux non seulement sur les agents pathogènes eux-mêmes mais également sur leurs hôtes.
Parmi les agents pathogènes des poissons à déclaration obligatoire par l'OIE (WOAH), le vSHV et le vNHI sont responsables de maladies aiguës chez un large spectre d'hôtes, notamment les salmonidés (truites et saumons) dans les principales zones de production : Europe, Asie et Amérique du Nord. Ils sont reconnus comme causant parmi les maladies les plus graves chez les poissons dans l'hémisphère nord, le vSHV étant connu pour infecter plus de 140 espèces d'élevage et sauvages, tant en eau douce qu'en milieu marin. Le vSHV et le vNHI sont tous deux des rhabdovirus appartenant au genre Novirhabdovirus. Avec une température de croissance optimale comprise entre 4 et 14 °C, ces virus infectent principalement les juvéniles, mais peuvent également infecter les poissons de toutes tailles et de tous âges, entraînant une mortalité allant de 5 à 90 %. À des températures d'eau plus élevées (15 à 18 °C), les pathologies causées par ces virus sont associées à des taux de mortalité plus faibles. Comme la plupart des virus à ARN, ils possèdent un génome relativement compact (11 kb), un temps de génération rapide et leur polymérase est intrinsèquement sujette à introduire des mutations aléatoires lors de la réplication. Ces caractéristiques permettent aux Novirhabdovirus de s'adapter rapidement à de nouvelles conditions environnementales et à de nouveaux hôtes. À ce titre, ils constituent des modèles viraux de choix pour étudier les effets de la hausse des températures sur leur évolution, leur adaptation et leur capacité à franchir la barrière d'espèces. En effet, l'émergence de souches virales naturellement thermo-adaptées a déjà été signalée sur le terrain (souchothèque du LNE, ANSES) et pourrait constituer une menace sérieuse en cas d'épidémie.
Concernant les espèces hôtes, le réchauffement des eaux est le principal facteur abiotique qui influence la physiologie des organismes ectothermes tels que les poissons. La température modifie les processus moléculaires et les structures cellulaires ainsi que les vitesses des réactions biochimiques, influençant ainsi le métabolisme, la croissance et les fonctions physiologiques clés des poissons, telles que le déterminisme et la maturation sexuels, la réponse au stress ou le système immunitaire. En tant que poïkilothermes, les poissons ont une température interne qui varie en fonction de celle de leur environnement. Une exposition chronique à une température élevée constitue un stress physiologique et métabolique qui peut nuire à la capacité des poissons à faire face à d'autres facteurs de stress et ainsi compromettre leur survie. Ces variations de température peuvent être considérables et constituent un modulateur puissant de l'activité immunitaire. Si les basses températures limitent la compétence immunitaire, les températures supérieures peuvent entraîner un état d'immunodéficience. Les changements de température peuvent donc avoir des effets négatifs ou positifs sur la résilience des poissons et leur capacité à monter une réponse appropriée contre les infections, en fonction de l'effet de ces changements sur l'immunocompétence.
Les projections des modèles climatiques indiquent que la température mondiale à la surface des continents et des eaux de surface (océans et rivières) pourrait augmenter de 0,4 à 2,6 °C d'ici 2050. Les températures optimales et létales (basses et élevées) varient considérablement d'une espèce de poisson à l'autre. La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l'une des espèces de salmonidés les plus populaires au monde en raison de sa grande valeur commerciale, de son taux de croissance élevé et de son introduction sur plusieurs continents. Selon l'historique des températures et de la souche, la truite arc-en-ciel peut survivre dans des eaux dont la température varie entre 0 et 29,8 °C. Cependant, la gamme de températures optimale pour ses performances physiologiques se situe entre 5 °C et 20 °C, tandis que pour le saumon atlantique (Salmo salar), elle varie entre 13 et 17 °C. Dans certaines zones géographiques, la température de l'eau pourrait approcher les limites de la gamme optimale pour certaines espèces actuellement élevées. Le changement climatique constitue donc un défi majeur qui aura un impact considérable sur la production et la durabilité de l'aquaculture en raison de l'émergence probable de virus et de nouveaux variants chez les poissons, ainsi que du réchauffement des eaux, de l'hypoxie, de l'augmentation des concentrations de CO2 et de l'acidification.
Notre projet s'intègre dans les grands objectifs scientifiques (GOS) du département Santé animale INRAE :
GOS1 - Comprendre, anticiper et lutter contre les maladies infectieuses émergentes animales
GOS2 : Adapter la maitrise de la Santé Animale à la transition agro-écologique.
GOS5 Réduire, raffiner et remplacer l'expérimentation animale
Il repose sur une approche intégrative multimodèles de la séquence (génome viral) à l'organisme (de la particule virale aux espèces cibles : organismes modèles et espèces de rente) pour l'étude de l'adaptation des novirhabdovirus au rechauffement climatique et et la prédiction épidémique.
L'objectif répond à des questions biologiques fondamentales en infectiologie des poissons et appliquées en réponse aux besoins de la filière et aux attentes sociétales.
L'objectif au centre du projet de thèse AquaTherm 2 est d'étudier les effets du réchauffement climatique sur les poissons au cours d'une infection par les deux principaux agents pathogènes viraux des salmonidés, le vNHI et le vSHV. Dans la continuité des travaux de recherche menés sur vNHI (projets AquaTherm et ThermoFish), le projet de thèse AquaTherm 2 poursuivra ces analyses sur vSHV du point de vue de l'hôte en évaluant l'impact des températures élevées sur les performances zootechniques et les compétences immunitaires des poissons. Ce projet intègre trois modèles d'étude dans une démarche Remplacer, Réduire, Raffiner (3R) allant des cellules de poisson, au modèle poisson zèbre jusqu'à l'espèce cible, la truite arc-en-ciel.
Les principales questions que soulèvent ce projet sont :
Tâche 1. Quels sont les effets de l'augmentation de la température sur les réponses de différentes lignées de cellules hôtes (cyprinidés, salmonidés) au cours d'une infection par des souches thermo-adaptées de vSHV ?
Tâche 2. En poisson zèbre, quels sont les réponses immunes innées et inflammatoires induites lors de l'infection de souches de vSHV ?
Tâche 3. Quel est l'impact de l'élévation de la température de l'eau sur l'espèce cible, la truite arc-en-ciel : performances zootechniques, biomarqueurs de stress thermique, compétences immunitaires et capacité à répondre aux challenges infectieux (vSHV et vNHI) ?
Tâche 1. Caractérisation des souches de terrain de vSHV thermo-adaptées : spectre de cellules hôtes et réponses innées
a. Analyses de l'infection de lignées de cellules de poisson par des souches de terrain de vSHV thermo-adaptées
À l'instar de ce qui a été réalisé pour vNHI (ANR ThermoFish), la caractérisation de la plasticité thermique intrinsèque d'un panel de souches de vSHV sera réalisée en sélectionnant des souches sauvages selon les critères de diversité des souches virales, diversité des espèces hôtes et niveaux de virulence. La capacité de réplication à une température permettant l'expression clinique in vivo (14 °C) et classiquement utilisée pour les tests diagnostiques officiels, mais également à des températures plus élevées (20 et 24 °C), sera comparée sur différentes lignées cellulaires, en surveillant les effets cytopathiques, la morphologie des plaques virales et la production virale au cours du temps (titrages). Ces essais permettront d'étudier l'effet de températures élevées sur la sensibilité des cellules à la réplication des différentes souches. Afin d'évaluer le niveau de stress cellulaire induit par les différentes températures, l'activité métabolique (kit CellTiter-Blue) et l'expression des marqueurs clés du stress thermique (protéine de choc thermique, hsp60 ; apoptose, cas3 ; stress du réticulum endoplasmique, atf6 ; stress oxydatif, gpx) seront mesurées par analyses transcriptionnelles par RT-qPCR.
b. Spectre de cellules hôtes des souches de vSHV (de terrain et de laboratoire) et réponses immunitaires innées
Les souches de terrain thermo-tolérentes de vSHV, les souches de laboratoires thermo-adaptées par passage successifs à 18-20 et 25 °C et les souches parentales de laboratoire (14 °C) seront caractérisées : (I) Pour leur capacité à se répliquer dans 5 lignées cellulaires de poissons (saumon atlantique (ASK), optimum à 21 °C ; cellules d'anguille (EK-1), 24 °C ; cellules de carpe (CCB), 25 °C ; cellules d'esturgeon, 24 °C ; fibroblastes de crapet arlequin (BF-2), 24 °C. (II) Pour déterminer les potentielles modifications de leur spectre de cellules hôtes. (III) Pour mesurer l'induction des voies de l'interféron au cours de l'infection par des analyses RT-qPCR (ifn de type I et isg15).
Tâche 2. Étude de l'infection par des souches de vSHV sélectionnées par phénotypage in vivo en poisson-zèbre
a. Modèle poisson zèbre pour l'étude in vivo des processus d'infection
La collaboration entre les partenaires VIM, IERP et ANSES a permis le développement de modèles d'infection robustes et reproductibles chez les larves de poisson-zèbre (espèce modèle) pour l'étude des novirhabdovirus. Les larves de poisson-zèbre présentent un intérêt particulier car elles s'adaptent à des températures variables allant de 20 à 33 °C et sont optiquement transparentes, ce qui permet de suivre directement les processus infectieux à l'aide de méthodes d'imagerie par fluorescence lorsqu'elles sont infectées par des virus fluorescents traçables. Les outils permettant d'évaluer la réponse immunitaire innée antivirale et l'accès à des lignées transgéniques fluorescentes (IERP) seront très utiles au projet en permettant des études approfondies des interactions hôte-pathogène. Sur la base des modèles précédemment établis et de technologies innovantes (cytométrie en flux non invasive sur poissons zèbres entiers, imagerie par fluorescence et bioluminescence ; cf. tableau ci-dessus), nous évaluerons les mécanismes d'entrée et de propagation de virus de terrain thermotolérants et de virus recombinant vSHV thermo-adaptés (rvSHV-25) et de variants chez les larves de poissons zèbres, conformément aux règles des 3R.
b. Analyses des réponses de l'hôte lors de l'infection par les souches sélectionnées de vSHV en poisson-zèbre
Les signes cliniques et taux de mortalité seront suivis quotidiennement pour 3 souches de vSHV sélectionnées sur la base des expériences in vitro. L'activation des réponses antivirales sera évaluée par RT-qPCR afin de mesurer les niveaux d'expression des voies de signalisation de l'interféron (ifn de type I et ISG tels que isg15, viperin) à différents temps après l'infection. En parallèle, nous surveillerons l'expression des cytokines pro-inflammatoires (il1 et tnf) et la dynamique des cellules immunitaires innées (neutrophiles et macrophages) par imagerie confocale de lignées de poissons zèbres transgéniques fluorescentes et infectées par des virus recombinants traçables optiquement. Les équipements et logiciels avancés de suivi de l'activité et du comportement des poissons-zèbres récemment acquis dans les installations de l'IERP seront particulièrement pertinents pour identifier les changements comportementaux induits par les infections à vSHV et/ou les réponses inflammatoires antivirales.
Tâche 3. Évaluation de la virulence de souches sélectionnées de vSHV chez les truites arc-en-ciel juvéniles
Des infections expérimentales ont été précédemment conduites en truites avec les variants rSHV-25 à 14 °C, dans le but d'évaluer leur atténuation et leur potentiel vaccinal. Une atténuation a été observée à cette température, cependant une virulence résiduelle a été remarquée et l'on ne sait rien de la virulence des variants rSHV-25 à des températures plus élevées. Ainsi, sur la base des résultats de la tâche précédente réalisée sur le modèle du poisson zèbre, les souches thermorésistantes sélectionnées seront ensuite testées sur l'espèce cible, la truite arc-en-ciel.
a. État de santé et compétence immunitaire des truites arc-en-ciel élevées à différentes températures
Les truites arc-en-ciel (lignée synthétique INRAE) seront élevées pendant 8 semaines à compter du moment du premier nourrissage selon 3 régimes thermiques : température basse (10 °C), température élevée (23 °C) ou température fluctuante de 10 à 23 °C. Un suivi régulier de la croissance des animaux et une analyse de certains biomarqueurs seront effectués afin d'évaluer l'effet de l'élévation de la température sur la santé des poissons et la modification de leur compétence immunitaire. Les paramètres immunitaires (numération des globules blancs, activité phagocytaire et mortalité leucocytaire) seront surveillés à partir du sang par cytométrie en flux. L'expression des gènes représentatifs des différents processus susceptibles d'être affectés par le stress thermique (hsp60, cas3, gpx, atf6-cf1Aa) sera analysée par RT-qPCR à partir du cerveau ou du foie.
b. Infection de truites arc-en-ciel élevées à différentes températures avec des souches sélectionnées.
Huit semaines après le premier nourrissage, les truites seront soumises à un challenge infectieux avec une souche thermo-adaptée in vitro de vSHV et des souches de terrain. Une surveillance de la cinétique d'apparition des signes cliniques sera effectuée en plus des évaluations quotidiennes des taux de mortalité cumulés. Les niveaux d'expression des effecteurs de la réponse à l'interféron (IFN de type I, ISG-15, viperin par RT-qPCR) et des réponses immunitaires pro-inflammatoires (TNF- ; à partir du sang ou de la rate, par RT-qPCR) seront analysés entre 72 et 96 heures après l'infection et couplée à l'évaluation de la charge virale dans différents organes (mélange de cerveau/rate/coeur/rein) ; pic de mortalité. La détection et la quantification des anticorps anti-vSHV chez la truite seront effectuées dans le plasma prélevé sur les survivants à la fin de l'expérience de challenge infectieux.
Au cours des dernières années, les partenaires du projet (IERP - VIM, INRAE et VIMEP, ANSES) ont développé des outils et technologies innovants et originaux pour mener des recherches sur ces questions scientifiques et ont obtenus des résultats intéressants montrant que les souches de vNHI se répliquant au-delà des températures usuelles de réplication des novirhabdovirus, ont une virulence accrue in vivo en modèle poisson zèbre (signes cliniques, taux de mortalité élevé). Dans cette nouvelle étape, nous étudierons l'impact des températures élevées du point de vue de l'hôte : le poisson zèbre et la truite arc en ciel (performances zootechniques, compétences immunitaires, réponses aux infections par vNHI) par des approches transcriptionnelles et phénotypiques.
L'étude sera également étendue à des souches de terrain de vSHV disponibles au sein de la souchothèque de l'ANSES et à des souches recombinantes thermo-adaptées in vitro par l'équipe de Stéphane Biacchesi et Jean Millet (VIM). Nous estimerons la plasticité génétique et phénotypique de ces souches et mènerons une analyse intégrée (in vitro et in vivo) et multi-espèces (poisson zèbre, truite arc-en-ciel) de caractérisation de la virulence. Les résultats générés, outre le renforcement des collaborations et de la synergie entre les 3 laboratoires partenaires (INRAE et ANSES), contribueront à anticiper l'émergence de souches virales capables de se répliquer à de plus hautes températures, donc sélectionnées par le stress thermique. La santé de deux espèces poissons sera examinée en réponse à ce stress pour modéliser et prédire les conséquences potentielles des augmentations et variations de température (facteurs abiotiques) sur la santé des poissons d'élevage en milieu dulcicole. Nous identifierons des biomarqueurs pertinents des réponses au stress thermique et examinerons les capacités de ces poissons à répondre à un challenge infectieux au regard des modulations probables de leur immunité.
Enjeux scientifiques et socio-économiques auxquels répond le projet
Le changement climatique constitue une menace existentielle sans précédent avec des implications graves pour la quasi-totalité des espèces, des écosystèmes et la biosphère. L'une des principales menaces est l'impact du changement climatique sur la sécurité alimentaire mondiale. Axé sur l'aquaculture, secteur de production ayant le plus fort taux de croissance (~6% par an, FAO 2022), le projet de thèse AquaTherm 2 s'inscrit dans la continuité du projet de thèse AquaTherm (cofinancé par INRAE et ANSES) et du projet de recherche ANR ThermoFish afin d'aborder l'une des préoccupations les plus urgentes auxquelles est confronté ce secteur crucial de la production alimentaire, à savoir : peut-on prédire les impacts de la hausse des températures dans les milieux aquatiques sur les principales maladies infectieuses virales et leurs hôtes piscicoles ?
L'un des principaux défis des prochaines décennies consistera à nourrir plus de 9 milliards d'individus dans un contexte de changement climatique. La consommation mondiale de poisson ne cesse d'augmenter et la demande future ne pourra être satisfaite par la seule pêche de capture. L'aquaculture représente la principale source de produits alimentaires aquatiques (FAO 2022). Environ 94 % de toutes les pêcheries d'eau douce se trouvent dans les pays en développement, fournissant de la nourriture et des moyens de subsistance à des millions de personnes parmi les plus pauvres du monde. Le développement d'une aquaculture durable doit relever plusieurs défis : garantir la santé et le bien-être des animaux, lutter contre les maladies infectieuses émergentes et adapter les pratiques agricoles à la demande sociétale et aux crises environnementales telles que les modifications anthropiques, les polluants et les changements globaux. Par conséquent, le contrôle des agents pathogènes qui affectent les poissons d'aquaculture sans compromettre les engagements environnementaux est une priorité cruciale. Cela nécessite de modifier les pratiques agricoles, de limiter l'utilisation d'antibiotiques et de développer des vaccins efficaces adaptés aux traitements de masse.
État de l'art scientifique - Originalité du projet
L'originalité du projet AquaTherm 2 repose sur la prise en compte de l'impact de l'augmentation des températures des eaux non seulement sur les agents pathogènes eux-mêmes mais également sur leurs hôtes.
Parmi les agents pathogènes des poissons à déclaration obligatoire par l'OIE (WOAH), le vSHV et le vNHI sont responsables de maladies aiguës chez un large spectre d'hôtes, notamment les salmonidés (truites et saumons) dans les principales zones de production : Europe, Asie et Amérique du Nord. Ils sont reconnus comme causant parmi les maladies les plus graves chez les poissons dans l'hémisphère nord, le vSHV étant connu pour infecter plus de 140 espèces d'élevage et sauvages, tant en eau douce qu'en milieu marin. Le vSHV et le vNHI sont tous deux des rhabdovirus appartenant au genre Novirhabdovirus. Avec une température de croissance optimale comprise entre 4 et 14 °C, ces virus infectent principalement les juvéniles, mais peuvent également infecter les poissons de toutes tailles et de tous âges, entraînant une mortalité allant de 5 à 90 %. À des températures d'eau plus élevées (15 à 18 °C), les pathologies causées par ces virus sont associées à des taux de mortalité plus faibles. Comme la plupart des virus à ARN, ils possèdent un génome relativement compact (11 kb), un temps de génération rapide et leur polymérase est intrinsèquement sujette à introduire des mutations aléatoires lors de la réplication. Ces caractéristiques permettent aux Novirhabdovirus de s'adapter rapidement à de nouvelles conditions environnementales et à de nouveaux hôtes. À ce titre, ils constituent des modèles viraux de choix pour étudier les effets de la hausse des températures sur leur évolution, leur adaptation et leur capacité à franchir la barrière d'espèces. En effet, l'émergence de souches virales naturellement thermo-adaptées a déjà été signalée sur le terrain (souchothèque du LNE, ANSES) et pourrait constituer une menace sérieuse en cas d'épidémie.
Concernant les espèces hôtes, le réchauffement des eaux est le principal facteur abiotique qui influence la physiologie des organismes ectothermes tels que les poissons. La température modifie les processus moléculaires et les structures cellulaires ainsi que les vitesses des réactions biochimiques, influençant ainsi le métabolisme, la croissance et les fonctions physiologiques clés des poissons, telles que le déterminisme et la maturation sexuels, la réponse au stress ou le système immunitaire. En tant que poïkilothermes, les poissons ont une température interne qui varie en fonction de celle de leur environnement. Une exposition chronique à une température élevée constitue un stress physiologique et métabolique qui peut nuire à la capacité des poissons à faire face à d'autres facteurs de stress et ainsi compromettre leur survie. Ces variations de température peuvent être considérables et constituent un modulateur puissant de l'activité immunitaire. Si les basses températures limitent la compétence immunitaire, les températures supérieures peuvent entraîner un état d'immunodéficience. Les changements de température peuvent donc avoir des effets négatifs ou positifs sur la résilience des poissons et leur capacité à monter une réponse appropriée contre les infections, en fonction de l'effet de ces changements sur l'immunocompétence.
Les projections des modèles climatiques indiquent que la température mondiale à la surface des continents et des eaux de surface (océans et rivières) pourrait augmenter de 0,4 à 2,6 °C d'ici 2050. Les températures optimales et létales (basses et élevées) varient considérablement d'une espèce de poisson à l'autre. La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l'une des espèces de salmonidés les plus populaires au monde en raison de sa grande valeur commerciale, de son taux de croissance élevé et de son introduction sur plusieurs continents. Selon l'historique des températures et de la souche, la truite arc-en-ciel peut survivre dans des eaux dont la température varie entre 0 et 29,8 °C. Cependant, la gamme de températures optimale pour ses performances physiologiques se situe entre 5 °C et 20 °C, tandis que pour le saumon atlantique (Salmo salar), elle varie entre 13 et 17 °C. Dans certaines zones géographiques, la température de l'eau pourrait approcher les limites de la gamme optimale pour certaines espèces actuellement élevées. Le changement climatique constitue donc un défi majeur qui aura un impact considérable sur la production et la durabilité de l'aquaculture en raison de l'émergence probable de virus et de nouveaux variants chez les poissons, ainsi que du réchauffement des eaux, de l'hypoxie, de l'augmentation des concentrations de CO2 et de l'acidification.
Notre projet s'intègre dans les grands objectifs scientifiques (GOS) du département Santé animale INRAE :
GOS1 - Comprendre, anticiper et lutter contre les maladies infectieuses émergentes animales
GOS2 : Adapter la maitrise de la Santé Animale à la transition agro-écologique.
GOS5 Réduire, raffiner et remplacer l'expérimentation animale
Il repose sur une approche intégrative multimodèles de la séquence (génome viral) à l'organisme (de la particule virale aux espèces cibles : organismes modèles et espèces de rente) pour l'étude de l'adaptation des novirhabdovirus au rechauffement climatique et et la prédiction épidémique.
L'objectif répond à des questions biologiques fondamentales en infectiologie des poissons et appliquées en réponse aux besoins de la filière et aux attentes sociétales.
L'objectif au centre du projet de thèse AquaTherm 2 est d'étudier les effets du réchauffement climatique sur les poissons au cours d'une infection par les deux principaux agents pathogènes viraux des salmonidés, le vNHI et le vSHV. Dans la continuité des travaux de recherche menés sur vNHI (projets AquaTherm et ThermoFish), le projet de thèse AquaTherm 2 poursuivra ces analyses sur vSHV du point de vue de l'hôte en évaluant l'impact des températures élevées sur les performances zootechniques et les compétences immunitaires des poissons. Ce projet intègre trois modèles d'étude dans une démarche Remplacer, Réduire, Raffiner (3R) allant des cellules de poisson, au modèle poisson zèbre jusqu'à l'espèce cible, la truite arc-en-ciel.
Les principales questions que soulèvent ce projet sont :
Tâche 1. Quels sont les effets de l'augmentation de la température sur les réponses de différentes lignées de cellules hôtes (cyprinidés, salmonidés) au cours d'une infection par des souches thermo-adaptées de vSHV ?
Tâche 2. En poisson zèbre, quels sont les réponses immunes innées et inflammatoires induites lors de l'infection de souches de vSHV ?
Tâche 3. Quel est l'impact de l'élévation de la température de l'eau sur l'espèce cible, la truite arc-en-ciel : performances zootechniques, biomarqueurs de stress thermique, compétences immunitaires et capacité à répondre aux challenges infectieux (vSHV et vNHI) ?
Tâche 1. Caractérisation des souches de terrain de vSHV thermo-adaptées : spectre de cellules hôtes et réponses innées
a. Analyses de l'infection de lignées de cellules de poisson par des souches de terrain de vSHV thermo-adaptées
À l'instar de ce qui a été réalisé pour vNHI (ANR ThermoFish), la caractérisation de la plasticité thermique intrinsèque d'un panel de souches de vSHV sera réalisée en sélectionnant des souches sauvages selon les critères de diversité des souches virales, diversité des espèces hôtes et niveaux de virulence. La capacité de réplication à une température permettant l'expression clinique in vivo (14 °C) et classiquement utilisée pour les tests diagnostiques officiels, mais également à des températures plus élevées (20 et 24 °C), sera comparée sur différentes lignées cellulaires, en surveillant les effets cytopathiques, la morphologie des plaques virales et la production virale au cours du temps (titrages). Ces essais permettront d'étudier l'effet de températures élevées sur la sensibilité des cellules à la réplication des différentes souches. Afin d'évaluer le niveau de stress cellulaire induit par les différentes températures, l'activité métabolique (kit CellTiter-Blue) et l'expression des marqueurs clés du stress thermique (protéine de choc thermique, hsp60 ; apoptose, cas3 ; stress du réticulum endoplasmique, atf6 ; stress oxydatif, gpx) seront mesurées par analyses transcriptionnelles par RT-qPCR.
b. Spectre de cellules hôtes des souches de vSHV (de terrain et de laboratoire) et réponses immunitaires innées
Les souches de terrain thermo-tolérentes de vSHV, les souches de laboratoires thermo-adaptées par passage successifs à 18-20 et 25 °C et les souches parentales de laboratoire (14 °C) seront caractérisées : (I) Pour leur capacité à se répliquer dans 5 lignées cellulaires de poissons (saumon atlantique (ASK), optimum à 21 °C ; cellules d'anguille (EK-1), 24 °C ; cellules de carpe (CCB), 25 °C ; cellules d'esturgeon, 24 °C ; fibroblastes de crapet arlequin (BF-2), 24 °C. (II) Pour déterminer les potentielles modifications de leur spectre de cellules hôtes. (III) Pour mesurer l'induction des voies de l'interféron au cours de l'infection par des analyses RT-qPCR (ifn de type I et isg15).
Tâche 2. Étude de l'infection par des souches de vSHV sélectionnées par phénotypage in vivo en poisson-zèbre
a. Modèle poisson zèbre pour l'étude in vivo des processus d'infection
La collaboration entre les partenaires VIM, IERP et ANSES a permis le développement de modèles d'infection robustes et reproductibles chez les larves de poisson-zèbre (espèce modèle) pour l'étude des novirhabdovirus. Les larves de poisson-zèbre présentent un intérêt particulier car elles s'adaptent à des températures variables allant de 20 à 33 °C et sont optiquement transparentes, ce qui permet de suivre directement les processus infectieux à l'aide de méthodes d'imagerie par fluorescence lorsqu'elles sont infectées par des virus fluorescents traçables. Les outils permettant d'évaluer la réponse immunitaire innée antivirale et l'accès à des lignées transgéniques fluorescentes (IERP) seront très utiles au projet en permettant des études approfondies des interactions hôte-pathogène. Sur la base des modèles précédemment établis et de technologies innovantes (cytométrie en flux non invasive sur poissons zèbres entiers, imagerie par fluorescence et bioluminescence ; cf. tableau ci-dessus), nous évaluerons les mécanismes d'entrée et de propagation de virus de terrain thermotolérants et de virus recombinant vSHV thermo-adaptés (rvSHV-25) et de variants chez les larves de poissons zèbres, conformément aux règles des 3R.
b. Analyses des réponses de l'hôte lors de l'infection par les souches sélectionnées de vSHV en poisson-zèbre
Les signes cliniques et taux de mortalité seront suivis quotidiennement pour 3 souches de vSHV sélectionnées sur la base des expériences in vitro. L'activation des réponses antivirales sera évaluée par RT-qPCR afin de mesurer les niveaux d'expression des voies de signalisation de l'interféron (ifn de type I et ISG tels que isg15, viperin) à différents temps après l'infection. En parallèle, nous surveillerons l'expression des cytokines pro-inflammatoires (il1 et tnf) et la dynamique des cellules immunitaires innées (neutrophiles et macrophages) par imagerie confocale de lignées de poissons zèbres transgéniques fluorescentes et infectées par des virus recombinants traçables optiquement. Les équipements et logiciels avancés de suivi de l'activité et du comportement des poissons-zèbres récemment acquis dans les installations de l'IERP seront particulièrement pertinents pour identifier les changements comportementaux induits par les infections à vSHV et/ou les réponses inflammatoires antivirales.
Tâche 3. Évaluation de la virulence de souches sélectionnées de vSHV chez les truites arc-en-ciel juvéniles
Des infections expérimentales ont été précédemment conduites en truites avec les variants rSHV-25 à 14 °C, dans le but d'évaluer leur atténuation et leur potentiel vaccinal. Une atténuation a été observée à cette température, cependant une virulence résiduelle a été remarquée et l'on ne sait rien de la virulence des variants rSHV-25 à des températures plus élevées. Ainsi, sur la base des résultats de la tâche précédente réalisée sur le modèle du poisson zèbre, les souches thermorésistantes sélectionnées seront ensuite testées sur l'espèce cible, la truite arc-en-ciel.
a. État de santé et compétence immunitaire des truites arc-en-ciel élevées à différentes températures
Les truites arc-en-ciel (lignée synthétique INRAE) seront élevées pendant 8 semaines à compter du moment du premier nourrissage selon 3 régimes thermiques : température basse (10 °C), température élevée (23 °C) ou température fluctuante de 10 à 23 °C. Un suivi régulier de la croissance des animaux et une analyse de certains biomarqueurs seront effectués afin d'évaluer l'effet de l'élévation de la température sur la santé des poissons et la modification de leur compétence immunitaire. Les paramètres immunitaires (numération des globules blancs, activité phagocytaire et mortalité leucocytaire) seront surveillés à partir du sang par cytométrie en flux. L'expression des gènes représentatifs des différents processus susceptibles d'être affectés par le stress thermique (hsp60, cas3, gpx, atf6-cf1Aa) sera analysée par RT-qPCR à partir du cerveau ou du foie.
b. Infection de truites arc-en-ciel élevées à différentes températures avec des souches sélectionnées.
Huit semaines après le premier nourrissage, les truites seront soumises à un challenge infectieux avec une souche thermo-adaptée in vitro de vSHV et des souches de terrain. Une surveillance de la cinétique d'apparition des signes cliniques sera effectuée en plus des évaluations quotidiennes des taux de mortalité cumulés. Les niveaux d'expression des effecteurs de la réponse à l'interféron (IFN de type I, ISG-15, viperin par RT-qPCR) et des réponses immunitaires pro-inflammatoires (TNF- ; à partir du sang ou de la rate, par RT-qPCR) seront analysés entre 72 et 96 heures après l'infection et couplée à l'évaluation de la charge virale dans différents organes (mélange de cerveau/rate/coeur/rein) ; pic de mortalité. La détection et la quantification des anticorps anti-vSHV chez la truite seront effectuées dans le plasma prélevé sur les survivants à la fin de l'expérience de challenge infectieux.
Le profil recherché
Formation et expérience requises :
- Master 2 dans le domaine de la biologie / de l'infectiologie.
- Connaissances en virologie cellulaire (culture cellulaire, production virale, ...),
- Maitrise des techniques de base de biologie moléculaire (extraction ARN/ADN, PCR classiques et temps réel, ...) et d'immunomarquage.
- Première expérience en expérimentation animale, idéalement sur poissons.
Compétences :
Rigueur
Curiosité et dynamisme
Sérieux
Ayant un bon sens de la communication
Adaptabilité
Savoir être
- Master 2 dans le domaine de la biologie / de l'infectiologie.
- Connaissances en virologie cellulaire (culture cellulaire, production virale, ...),
- Maitrise des techniques de base de biologie moléculaire (extraction ARN/ADN, PCR classiques et temps réel, ...) et d'immunomarquage.
- Première expérience en expérimentation animale, idéalement sur poissons.
Compétences :
Rigueur
Curiosité et dynamisme
Sérieux
Ayant un bon sens de la communication
Adaptabilité
Savoir être
Compétences requises
- PCR
- Dynamisme