Thèse Marquage Régiosélectif d'Une Protéine Thérapeutique pour une Analyse Multimodale Multi-Échelle de sa Biodistribution et de l'Engagement de sa Cible In Vivo H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Santé et médicaments École doctorale : Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué Laboratoire de recherche : Médicaments et Technologies pour la Santé Direction de la thèse : Daniel GILLET ORCID 0000000304773599 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-04-22T23:59:59 Ce projet de thèse vise à développer une méthode innovante pour mieux comprendre le devenir in vivo des protéines thérapeutiques, au-delà des approches classiques de biodistribution. Aujourd'hui, celles-ci renseignent encore mal l'exposition réelle du médicament à son site d'action, son interaction avec sa cible et ses effets éventuels hors cible. L'objectif est donc de mettre au point une approche capable de suivre une protéine thérapeutique de l'échelle de l'organisme entier jusqu'au niveau subcellulaire, afin de relier sa présence dans les tissus à son engagement de cible et à son mécanisme d'action.Le projet porte sur DTR8, une protéine thérapeutique antagoniste de HB-EGF/pro-HB-EGF, développée pour traiter la glomérulonéphrite à croissants, une maladie rénale rare et sévère caractérisée par des lésions glomérulaires liées à l'expression pathologique de HB-EGF. DTR8 a pour but de bloquer cette voie et de prévenir les dommages rénaux.

La thèse poursuivra plusieurs objectifs : développer un marquage régiosélectif multimodal de DTR8 compatible avec différentes analyses in vitro, ex vivo et in vivo ; caractériser sa pharmacocinétique et sa biodistribution chez l'animal sain et malade ; démontrer son engagement de cible dans le rein pathologique ; étudier le devenir cellulaire et subcellulaire du complexe formé avec sa cible ; et évaluer la portée translationnelle de cette méthodologie pour le développement préclinique d'autres protéines thérapeutiques.

La stratégie repose sur l'introduction contrôlée, via un marquage enzymatique et une chimie click, de plusieurs types de traceurs sur DTR8 : fluorophores, sonde tritiée, biotine et sonde photoactivable. Ces versions marquées permettront d'analyser la protéine selon différentes modalités complémentaires. Leur activité biologique sera d'abord vérifiée sur des cellules exprimant la cible. Les études in vivo seront ensuite réalisées chez des souris humanisées pour HB-EGF, saines ou atteintes de glomérulonéphrite à croissants, ainsi que chez des souris contrôle ne reconnaissant pas DTR8, afin de distinguer ce qui relève de la cible de ce qui dépend des propriétés propres de la molécule ou de l'état pathologique du rein.

La biodistribution sera étudiée à plusieurs échelles grâce à l'imagerie de fluorescence in vivo, à la quantification dans les organes, puis à des approches de haute résolution permettant de localiser DTR8 dans les cellules et compartiments subcellulaires. L'engagement de cible sera confirmé par des méthodes de cross-linking photoactivable et de protéomique, ainsi que sur des biopsies rénales humaines.

Les résultats attendus sont une preuve de concept méthodologique forte et une description intégrée du comportement de DTR8 chez l'animal sain et malade : distribution, élimination, accumulation tissulaire éventuelle, accès au rein, liaison à la cible et devenir intracellulaire. Au-delà de DTR8, cette thèse devrait fournir un cadre expérimental transposable pour mieux évaluer la biodistribution, l'engagement de cible et la pharmacologie tissulaire des nouvelles protéines thérapeutiques, en réponse à un besoin clairement identifié par l'industrie pharmaceutique. Problématique de recherche
Le développement des protéines thérapeutiques se heurte aujourd'hui à une limite méthodologique majeure : les approches conventionnelles de biodistribution ne suffisent pas à décrire, à elles seules, l'exposition réelle du médicament à son site d'action, son interaction avec sa cible, ni ses éventuels effets hors cible. Le « white paper » publié par plusieurs grands groupes pharmaceutiques souligne ainsi que la biodistribution in vivo traditionnelle doit désormais être complétée par une caractérisation fine, à l'échelle microscopique, des interactions avec la cible et des déterminants tissulaires et cellulaires de l'exposition.
Dans ce contexte, le projet de thèse vise à développer et exploiter un marquage régiosélectif multimodal d'une protéine thérapeutique afin de suivre cette protéine de l'organisme entier à l'échelle subcellulaire, dans un modèle murin humanisé pour la cible, sain et pathologique. L'objectif est de relier la biodistribution multi-échelle de la protéine thérapeutique à son engagement de cible, à son devenir cellulaire et subcellulaire, et, au-delà, à la compréhension de son mécanisme d'action dans la pathologie considérée.
Ainsi, la thèse ne se limite pas à étudier une protéine thérapeutique donnée : elle propose une méthodologie innovante et transposable pour documenter la biodistribution, l'engagement de cible et la pharmacologie tissulaire de nouvelles protéines thérapeutiques, en réponse à un besoin clairement exprimé par l'industrie pharmaceutique. Objectifs
Le projet de thèse a pour objectif de développer une approche intégrée permettant de caractériser une protéine thérapeutique à plusieurs niveaux d'échelle, depuis l'organisme entier jusqu'au compartiment subcellulaire, afin de mieux comprendre les déterminants de son activité in vivo. Cette caractérisation portera sur DTR8, protéine thérapeutique antagoniste de HB-EGF/pro-HB-EGF destinée au traitement de la glomérulonéphrite à croissants (GNC).
Cette maladie rénale rare et sévère est caractérisée par la dédifférenciation et la prolifération des cellules glomérulaires liée à l'expression d'HB-EGF par ces cellules en réponse à une agression auto-immune. DTR8 prévient les lésions glomérulaires en bloquant HB-EGF et pro-HB-EGF

Les objectifs sont :
1. Développer un marquage régiosélectif multimodal de la protéine permettant l'introduction contrôlée de différents traceurs chimiques compatibles avec des analyses in vitro, ex vivo et in vivo.
2. Caractériser la pharmacocinétique et la biodistribution multi-échelle de DTR8 chez des organismes sains et malades, afin de distinguer la part liée à l'interaction avec la cible de celle relevant de mécanismes indépendants de la cible.
3. Démontrer l'engagement de la cible HB-EGF/pro-HB-EGF dans les tissus rénaux pathologiques, chez la souris humanisée.
4. Étudier le devenir du complexe DTR8/cible pro-HB-EGF à l'échelle cellulaire et subcellulaire, notamment son internalisation, son trafic endolysosomal, sa dégradation ou son éventuel recyclage.
5. Évaluer la portée translationnelle de cette méthodologie pour le développement préclinique des protéines thérapeutiques et pour l'identification d'éventuels signaux « on-target » ou « off-target ». Méthode
Un marquage régiosélectif de DTR8 sera réalisé à l'aide d'une étiquette peptidique reconnue par la transglutaminase microbienne, permettant l'introduction d'une fonction azoture, puis le greffage par chimie click de différents traceurs : fluorophores, sonde tritiée, biotine et sonde photoactivable. Cette stratégie doit fournir une boîte à outils cohérente de versions marquées de DTR8, adaptées aux différentes modalités analytiques sur organisme entier vivant, sur organes isolés, sur cellules et à l'échelle subcellulaire.
L'activité fonctionnelle des protéines marquées sera vérifiée sur cellules VERO exprimant pro-HB-EGF, afin de s'assurer que le marquage conserve les propriétés biologiques de DTR8. La liaison à la cible sera ensuite étudiée par microscopie de fluorescence, comptage radioactif, capture via biotine et protéomique.
Les études in vivo seront menées chez des souris humanisées pour HB-EGF, saines ou atteintes de GNC, ainsi que chez des souris contrôle dont la cible murine n'est pas reconnue par DTR8. Cette comparaison doit permettre de discriminer la part de la biodistribution liée à la présence de la cible de celle liée aux propriétés intrinsèques de la protéine ou à l'altération du rein pathologique.
La biodistribution sera analysée à plusieurs échelles : imagerie in vivo par fluorescence, quantification dans les organes par bêta-imagerie et comptage radioactif, puis localisation cellulaire et subcellulaire par micro-autoradiographie haute résolution et fractionnement cellulaire. L'engagement de la cible sera confirmé par approches de cross-linking photoactivable et LC-MS/MS, ainsi que sur biopsies rénales humaines (par notre collaborateur à l'INSERM, Pierre-Louis Tharaux).
Cette approche méthodologique a vocation à relier la présence du médicament dans les tissus, sa localisation fine, sa liaison effective à la cible et ses conséquences biologiques, conformément aux recommandations industrielles actuelles pour les protéines thérapeutiques.

M2 Biologie, biotechnologie, école d'ingénieur en biologie/biotechnologie, médecin, pharmacien...
Expérience en biologie, biologie moléculaire, biochimie des protéines, culture cellulaire, pharmacologie...