Thèse Fabrication et Stimulation d'Organoîdes Cérébraux Structurés en Couches par Lévitation Acoustique H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : ESPCI Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la ville de Paris (PSL) École doctorale : Sciences Mécaniques, Acoustique, Electronique et Robotique de Paris Laboratoire de recherche : Laboratoire de Physique et Mécanique des Milieux Hétérogènes Direction de la thèse : Jean-Luc AIDER ORCID 000000032658828X Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-22T23:59:59 Ce projet de thèse vise à développer une approche innovante de manipulation cellulaire par acoustophorèse afin de générer des structures neuronales complexes, telles que des mono-couches organisées et des assemblages 3D de type organoïdes. Cette technique repose sur l'utilisation de la force de radiation acoustique (FRA) dans des cavités résonantes permettant de piéger et organiser, sans contact, des cellules en suspension en plans de lévitation au niveau de noeuds de pression. L'objectif principal est d'exploiter une cavité acoustique développée par l'équipe AcoustoFluidiX du PMMH pour produire des tissus neuronaux structurés et fonctionnels, en s'appuyant sur des résultats préliminaires déjà validés sur différents types cellulaires. La lévi-tation acoustique favorise en outre la différenciation cellulaire, ouvrant la voie à une optimisation des temps de culture et des propriétés biologiques.
Le projet s'articule autour de trois axes. Le premier consiste à fabriquer des tissus neuronaux stratifiés en générant des feuillets cellulaires confluents à partir de neurones de rongeur et hu-mains. Leur viabilité, leur maturation (croissance axonale et dendritique) et leur connectivité sy-naptique seront caractérisées, notamment via imagerie calcique. La superposition contrôlée de ces feuillets, obtenue par ajustement des paramètres acoustiques (géométrie, fréquence), per-mettra d'étudier la transition d'organisations bidimensionnelles vers des architectures tridimen-sionnelles interconnectées.
Le deuxième axe porte sur l'effet de la stimulation acoustique et des contraintes mécaniques sur la maturation et l'activité neuronale. L'acoustophorèse permettra d'assembler des neurones de différentes origines en structures organisées, y compris des architectures radiales multicouches. L'exposition prolongée aux ultrasons pourrait accélérer la différenciation des cellules souches neurales. Par ailleurs, la modulation de l'amplitude et de la fréquence de la FRA permettra d'exercer des sollicitations mécaniques contrôlées sur les structures cellulaires ou les hydrogels de support. Ces approches visent à modéliser l'influence encore mal comprise des pulsations mécaniques physiologiques (liées au flux sanguin ou à la respiration) sur le fonctionnement céré-bral.
Le troisième axe concerne la fabrication de greffons neuronaux structurés en vue d'applications en thérapie cellulaire. Les tissus produits, organisés en couches dans des hydrogels biocompa-tibles, seront transplantés dans des modèles murins afin d'évaluer leur capacité d'intégration et de reconnexion avec le tissu cérébral hôte.
Ce projet s'inscrit dans un contexte scientifique où les modèles actuels présentent des limita-tions importantes. Les cultures 2D offrent un contrôle cellulaire fin mais ne reproduisent pas l'organisation tridimensionnelle du cerveau, tandis que les modèles 3D existants (neurosphères, tranches cérébrales) manquent de contrôle spatial et fonctionnel. Les technologies émergentes, comme la bio-impression, restent limitées en précision et en reproduction fidèle des interactions cellulaires. Dans ce cadre, la manipulation acoustique apparaît comme une solution prometteuse, capable de structurer des tissus complexes avec une résolution fine tout en préservant la viabili-té cellulaire.
Ainsi, ce projet ambitionne de proposer une nouvelle plateforme expérimentale permettant de re-construire des réseaux neuronaux organisés en 3D et d'étudier l'impact des contraintes méca-niques sur leur fonctionnement, ouvrant des perspectives en neurosciences fondamentales, en ingénierie tissulaire et en médecine régénérative
Le cerveau humain est un organe complexe composé de milliards de cellules et d'interactions cellulaires interconnectées encore plus complexes. Les modèles expérimentaux actuels utilisés pour étudier le développement, la physiologie et les maladies cérébrales vont des modèles ani-maux entiers, qui préservent les structures anatomiques mais limitent considérablement l'expé-rimentation au niveau cellulaire, aux systèmes de culture de cellules dissociées, qui permettent une manipulation fine du phénotype cellulaire mais ne reproduisent pas l'environnement cérébral hautement organisé et instructif. Manipuler les neurones, et plus largement les cellules cérébrales, représente donc un défi majeur. Premièrement, ils sont organisés in vivo en structures 3D com-plexes, mais ils possèdent également des prolongements spatiaux, via leurs axones et dendrites, bien plus étendus que ceux des autres cellules, créant ainsi un réseau de connexions bien orga-nisé (microcircuits et macroconnectome). Ces connexions sont essentielles à la fonction neuro-nale, mais aussi, comme nous le verrons, à la compréhension des maladies du système nerveux central.
L'un des principaux problèmes actuels est que les cultures cellulaires 2D conventionnelles ne permettent pas d'obtenir l'organisation contrôlée nécessaire à l'étude de ces questions. Des progrès importants ont été réalisés concernant cette dernière question, notamment par nos équipes, offrant la possibilité de contrôler à l'échelle micrométrique la différenciation entre axones et dendrites, le guidage à longue distance, la compartimentation des populations neuronales et la connexion polarisée entre différentes populations neuronales (1-3). Cependant, à ce jour, ces technologies restent bidimensionnelles et, de ce fait, leur capacité à imiter ou à remplacer les modèles in vivo est limitée.

Afin de surmonter ces limitations, d'intenses efforts ont été déployés pour développer des mo-dèles in vitro tridimensionnels. Ceci a conduit au concept de « sphéroïdes », dans lesquels les cellules sont cultivées en agrégats 3D compacts et essentiellement sphériques, de quelques centaines de micromètres de diamètre (4). En neurosciences, ces modèles sont également con-nus sous le nom de « neurosphères ». Ils permettent une croissance tridimensionnelle, mais pré-sentent un inconvénient: les connexions neuronales et l'organisation au sein de la neurosphère ne sont pas contrôlées (5). Pour être complet, les études in vitro sur des tranches de cerveau cons-tituent également des alternatives populaires, mais elles sont difficiles à obtenir, ne permettent pas d'exploiter pleinement le potentiel des technologies de cellules souches et leur durée de vie est limitée. De plus, si le réseau de connectivité entre les différents neurones est plus réaliste que dans les neurosphères (du point de vue physiologique), il n'est pas contrôlable, et l'adres-sage individuel des neurones est difficile et invasif. Ainsi, les neurosphères et les tranches de cerveau sont confrontées à de nombreux problèmes communs aux modèles de neurosciences in vivo. La capacité à manipuler précisément des cellules vivantes en trois dimensions est essen-tielle pour de nombreuses applications potentielles en biophysique, en ingénierie tissulaire et en neurosciences. En effet, des études récentes sur les technologies de cellules souches ont prou-vé que le microenvironnement 3D permet aux cellules d'acquérir des phénotypes hautement dif-férenciés et aux assemblages cellulaires de s'auto-organiser en organoïdes qui reproduisent des propriétés clés des organes animaux.

Les progrès des approches microtechnologiques ont favorisé le développement de nouveaux outils permettant la manipulation des cellules, de l'état unique à la reconstruction de systèmes de co-cultures complexes. Cependant, les méthodes microtechnologiques actuelles sont généra-lement limitées par la nécessité de reconstruire et de reproduire les communications intercellu-laires et les interactions cellule-environnement en 3D. De ce fait, la bio-impression exige une re-production fidèle de l'architecture multicellulaire (6). De nouvelles technologies de bioconstruction, qui permettraient à terme la fabrication d'un organe en tous points semblable aux organes hu-mains, sont actuellement en développement et progressent de manière significative. Les ap-proches de bio-impression (impression 3D, structuration cellulaire, stéréolithographie) ou la dé-cellularisation et la recellularisation d'un organe sont évaluées dans le but de fournir un organe implantable pour l'homme. Toutefois, il n'existe actuellement aucune méthode capable de faciliter la formation de structures multicellulaires complexes avec une grande précision, une grande po-lyvalence, de multiples dimensions et une résolution unicellulaire, tout en préservant la viabilité, l'intégrité et la fonction des cellules. Par conséquent, il est crucial de développer de nouvelles méthodes pour surmonter ces limitations (7-8).

Dans ce projet, au travers de l'utilisation des techniques de lévitation acoustique on cherchera à structurer des neurones en couches superposées et interconnectées entre elles et à modéliser les phénomènes de pulsations mécaniques du cerveau au travers du contrôle des paramètres acoustiques sur les feuillets neuronaux reconstitués.
Dans le cadre de cette thèse on cherchera à développer une technique de manipulation cellulaire par force acoustique de cellules neuronales pour générer des objets plus complexes et réalistes comme des monocouches ou des organoïdes de manière plus simple et plus efficace que les techniques conventionnelles. Cette technique, appelée acoustophorèse, repose sur la génération d'une force de radiation acoustique (FRA) dans des résonateurs acoustiques, qu'il s'agisse de microcavités fermées ou de microcanaux. Grâce à des paramètres géométriques et physiques appropriés, il est possible de manipuler un grand nombre d'objets micrométriques (particules ou cellules) en suspension, sans contact. La FRA induit la formation de couches de particules ou cel-lules en lévitation acoustique (LA) au niveau de chaque noeud de pression créé dans la cavité. L'objectif principal du projet est d'utiliser une nouvelle cavité acoustique adaptée à la culture cel-lulaire et développée par l'équipe AcoustoFluidiX du PMMH afin de générer une ou plusieurs mo-nocouches ou ou agrégats 3D de cellules neuronales (Figure 1). Ces systèmes de culture cellu-laires en lévitation acoustique ont déjà été validés et utilisés par les deux équipes (PMMH et Neuro-S) avec des cellules souches mésenchymateuses humaines (Jeger Madiot et al.), des hé-patocytes (Rabiet et al.) et des glioblastomes dérivés de patients (Mousset et al.). Il est impor-tant de noter que la culture en lévitation acoustique induit une différenciation cellulaire accrue dans différents types cellulaires, vraisemblablement par des mécanismes similaires à ceux impli-qués dans les processus neuromodulateurs induits par les ultrasons. Nous chercherons égale-ment à exploiter cette propriété pour agir sur les objets fabriqués et cultivés en lévitation acous-tique avec pour objectifs de réduire les temps de culture cellulaire et/ou d'améliorer leurs pro-priétés biologiques.

Le projet de thèse comporte 3 principaux objectifs.

1) Fabrication de tissus structurés en couches par force acoustique

Sur la base de données préliminaires solides démontrant la faisabilité du projet (Fig. 2), des neu-rones dérivés de cerveau de rongeur, produits de façon routinière au laboratoire Neuro-SU, se-ront ensemencés dans des chambres de culture cellulaire acoustophorétiques permettant la formation de feuillets confluents de cellules uniques dans un milieu acoustophorétique (AL). Des feuillets neuronaux dérivés de neurones de rongeur (à maturation rapide) et humains (à matura-tion lente) seront cultivés dans un milieu AL pendant des durées croissantes, et la différenciation neuronale sera caractérisée « hors puce » par analyse immunocytochimique conventionnelle afin d'étudier : i) la survie cellulaire, ii) la croissance axonale et dendritique, iii) la connectivité synap-tique. L'activité collective des feuillets neuronaux sera caractérisée à l'aide de protocoles d'ima-gerie calcique rapide. Notre stratégie consistera ensuite à construire des feuillets confluents su-perposés. Pour ce faire, il sera nécessaire de modifier la hauteur de la cavité acoustique et/ou la fréquence des ultrasons afin de générer N noeuds de pression à distance internodale contrôlable (Jeger Madiot et al., 2022), qui constitueront autant de zones de formation de monocouches (Fig. 1). Les feuillets neuronaux cultivés au niveau des noeuds de pression seront ensuite mis en con-tact afin d'étudier la connectivité progressive de la 2D à la 3D.

2) Effets de stimulation acoustique et de l'actuation mécanique sur la maturation et l'activité des structures neuronales.

Grâce à la technologie ARF, des neurones provenant de différentes régions cérébrales seront agrégés et cultivés en milieu AL pendant une durée contrôlée avant d'être transférés dans des systèmes de culture cellulaire conventionnels. L'équipe du PMMH a conçu de nouvelles cavités et de nouveaux canaux permettant la structuration spatiale des monocouches. Il est ainsi pos-sible de créer une couche de cellules organisée radialement, avec des couches annulaires con-centriques de différents types cellulaires (Mousset et al., 2025). Nous envisageons trois princi-paux avantages : 1) la culture à long terme de neurones en milieu AL accélérera la différenciation des cellules souches neurales, une limitation essentielle lors de l'utilisation de neurones dérivés de cellules iPS humaines. Cet effet dépendant des effets neurostimulateurs des ultrasons ; 2) l'auto-organisation contrôlée d'organoïdes stratifiés sous l'effet de la force mécanique induite par l'ARF ; 3) l'actuation mécanique des feuillets neuronaux piégés dans des hydrogels. Deux effets synergiques sont envisagés en modifiant 1) l'ARF (amplitude) sur les structures cellulaires provo-quant ainsi une modification de la pression acoustique locale sur les cellules. 2) en modifiant la distance inter noeuds (modification de fréquence), ce qui provoque un déplacement des plans cellulaires contre les hydrogels de soutient (fréquences). Ces deux approches permettent de modéliser un phénomène encore très mal connu et modélisé en neurosciences : le rôle des pulsa-tions mécaniques basses fréquences (<1Hz) induites par le flux sanguin pulsatiles et la respira-tion pulmonaire.

3) Fabrication de greffons structurés pour la thérapie cellulaire

En fonction des deux premiers objectifs, on cherchera à fabriquer des greffons de structure neu-ronales en couches dans une optique de thérapie cellulaire des maladies neurologiques. Les structures neuronales structurées et cultivées en couches dans un hydrogel neurocompatible seront greffées dans des modèles de souris dans le cadre d'une collaboration avec un tiers (A. Gaillard, Université de Poitiers). Les feuillets neuronaux (dérivés de souris transgéniques GFP) seront transplantés chez des souris afin d'évaluer la reconnexion des couches avec le parenchyme cérébral hôte.

Le candidat devra avoir une double formation en physique et biologie. Le sujet est multi-disciplinaire et demandera un réel goût pour l'expérimentation (microfluidique, microfabrication, microscopie). Il faudra également faire des simulations numériques (Comsol) et comprendre les aspects théoriques pour aborder efficacement les problématiques acoustofluidiques (structuration du champ acoustique,
lévitation d'objets non sphériques). L'étudiant devra également avoir une formation en biologie pour pouvoir réaliser des cultures cellulaires et des expériences avec des neurones.