Thèse Caractérisation Structurale et Fonctionnelle d'Une Famille d'Effecteurs d'Avirulence de Leptosphaeria Maculans un Champignon Pathogène du Colza Implication dans le Processus Infectieux Fongi H/F - 75

Établissement : Université Paris-Saclay GS Biosphera - Biologie, Société, Ecologie & Environnement, Ressources, Agriculture & Alimentation
École doctorale : Sciences du Végétal : du gène à l'écosystème
Laboratoire de recherche : BIOlogie GEstion des Risques en agriculture
Direction de la thèse : Isabelle FUDAL-GROLIER ORCID 0000000291059432
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-06T23:59:59Pour coloniser leurs plantes hôtes, les agents pathogènes fongiques expriment des effecteurs capables de moduler les réponses de défense de l'hôte et de faciliter l'infection. Certains de ces effecteurs sont ciblés par des protéines de résistance de la plante (R), et sont alors appelés protéines d'avirulence (AVR). La reconnaissance d'une protéine AVR par une protéine R de la plante déclenche un ensemble de réponses de défense conduisant le plus souvent à une mort cellulaire localisée appelée réponse hypersensible. La sélection de cultivars portant des gènes R majeurs contre les agents pathogènes est un outil puissant pour contrôler les maladies. Cependant, le déploiement massif d'un seul gène R dans les parcelles exerce une forte pression de sélection contre les agents pathogènes avirulents, entraînant une évolution rapide vers la virulence. Leptosphaeria maculans est responsable de la nécrose du collet du colza (Brassica napus). Le principal moyen de lutte contre ce champignon est la lutte génétique via l'utilisation de résistances spécifiques (appelées Rlm) qui reconnaissent des protéines AVR correspondantes (appelées AvrLm). Des interactions complexes qui diffèrent des interactions gène-pour-gène classiques ont été mises en évidence dans ce pathosystème, dont le masquage de plusieurs protéines AVR par une autre protéine AVR, AvrLm4-7, appartenant à une même famille structurale appelée LARS. Ajoutant un nouveau niveau de complexité, des résultats préliminaires ont révélé des interactions atypiques entre des isolats de L. maculans possédant AvrLm4-7 et des génotypes de colza possédant le gène Rlm7, montrant une variation quantitative de la résistance. L'objectif de la thèse est d'étudier structuralement et fonctionnellement la famille d'effecteurs d'avirulence LARS afin de déterminer leur implication dans le processus infectieux de L. maculans et de caractériser leurs interactions avec les protéines de résistance du colza en étudiant : (i) la diversité phénotypique observée lors des interactions entre effecteurs AVR LARS et protéines R du colza et les mécanismes moléculaires sous-jacents ; (ii) les déterminants moléculaires et les mécanismes impliqués dans la capacité d'AvrLm4-7 à supprimer la reconnaissance d'autres AVR par leur protéines R ; (iii) l'implication des membres de la famille LARS dans le processus infectieux de L. maculans.

Pour coloniser leurs plantes hôtes, les agents pathogènes fongiques expriment, au cours du cycle infectieux, des ensembles de gènes dont des gènes codant des protéines effectrices (ou effecteurs) capables de moduler les réponses de défense de l'hôte et de faciliter l'infection (Sanchez-Vallet et al., 2018 ; Rocafort et al., 2020). Alors que les effecteurs fongiques ont d'abord été considérés comme spécifiques d'une espèce ou d'un génotype, plusieurs études récentes montrent que ces protéines appartiennent à un ensemble restreint de familles structurales (pour revue Le Naour-Vernet et al., 2025). Certains de ces effecteurs sont ciblés par des protéines de résistance de la plante (R), et sont alors appelés protéines d'avirulence (AVR). La reconnaissance d'une protéine AVR par une protéine R de la plante déclenche un ensemble de réponses de défense regroupées sous le terme d''Effector-Triggered Immunity (ETI), conduisant le plus souvent à une mort cellulaire localisée appelée réponse hypersensible (HR). La sélection de cultivars portant des gènes R majeurs contre les agents pathogènes est un outil puissant pour contrôler les maladies. Cependant, le déploiement massif d'un seul gène R dans les parcelles exerce une forte pression de sélection contre les agents pathogènes avirulents, entraînant une évolution rapide vers la virulence par différents mécanismes : la délétion du gène AVR, son inactivation, la répression de son expression, des mutations ponctuelles permettant d'échapper à la reconnaissance tout en maintenant la fonction effectrice de la protéine AVR, ou l'acquisition de nouveaux effecteurs qui suppriment l'ETI (Rouxel et Balesdent, 2017). Dans certains cas, des variations dans la séquence de la protéine AVR entrainent une variation quantitative du phénotype de résistance de l'hôte (voir pour exemple Meile et al., 2022).
Le champignon ascomycète Leptosphaeria maculans est responsable de la nécrose du collet du colza (Brassica napus). Le principal moyen de lutte contre ce champignon est la lutte génétique. En effet, dans le modèle d'interaction L. maculans/colza, les résistances spécifiques (nommées Rlm) qui reconnaissent les protéines d'avirulence correspondantes (nommées AvrLm) sont largement utilisées conduisant à l'induction rapide d'une HR lors de l'infection. Cependant, les sources de résistance spécifique sont rares chez le colza et les études visent soit à l'identification et l'introgression de résistances provenant d'autres espèces du genre Brassica pour diversifier les ressources disponibles, soit à l'optimisation de la durabilité des résistances disponibles (surveillance de la fréquence d'apparition de souches virulentes au sein des populations d'agents pathogènes, stratégies d'alternance et/ou de pyramidage de résistances pour un contrôle plus durable de la maladie). A ce jour, douze interactions Rlm - AvrLm ont été caractérisées dans le pathosystème B. napus - L. maculans, mettant en évidence des interactions complexes qui diffèrent des interactions classiques gène-pour-gène (pour revue Petit-Houdenot et Fudal, 2017 ; Rouxel et Balesdent, 2017). Notamment, plusieurs protéines Rlm reconnaissent le même effecteur : Rlm4 et Rlm7 reconnaissent AvrLm4-7, et Rlm5 et Rlm9 reconnaissent AvrLm5-9 (Parlange et al., 2009 ; Ghanbarnia et al. 2018). D'autre part, l'effecteur AvrLm4-7 a la capacité de supprimer la résistance médiée par les interactions AvrLm3/Rlm3 et AvrLm5-9/Rlm9 (Plissonneau et al., 2016 ; Ghanbarnia et al., 2018). AvrLm4-7, AvrLm5-9 et AvrLm3 appartiennent à la même famille structurale, appelée LARS (pour Leptosphaeria AviRulence and Supressing ; Lazar et al., 2022), à laquelle appartient également AvrLmS-Lep2 dont la résistance correspondante, RlmS, a récemment été introduite au champ. Ajoutant un nouveau niveau de complexité, des résultats préliminaires ont révélé des interactions atypiques entre certains isolats de L. maculans possédant AvrLm4-7 et certains génotypes de colza possédant Rlm7 : un début d'infection avec apparition d'une lésion nécrotique suivi d'une résistance plus ou moins tardive, se caractérisant par une HR en bordure de lésion, permettant de bloquer l'infection.

L'objectif de la thèse est d'étudier structuralement et fonctionnellement la famille d'effecteurs d'avirulence LARS afin de déterminer leur implication dans le processus infectieux de L. maculans et de caractériser leurs interactions avec les protéines de résistance du colza.
Ce projet de thèse permettra de répondre aux questions suivantes :
- Quelle est la diversité phénotypique observée lors des interactions entre effecteurs AVR LARS et protéines R du colza et quels sont les mécanismes moléculaires sous-jacents ?
- Quels sont les déterminants moléculaires et les mécanismes impliqués dans la capacité d'AvrLm4-7 à supprimer l'ETI ?
- Quelle est l'implication des membres de la famille LARS dans le processus infectieux de L. maculans ? Les membres de cette famille ciblent-ils des processus cellulaires communs ?

Cette étude se focalisera sur les effecteurs AVR de la famille LARS (AvrLm4-7, AvrLm3, AvrLm5-9 et AvrLmS-Lep2) et les protéines Rlm correspondantes (Rlm4, Rlm7, Rlm3, Rlm9, Rlm5 et RlmS) qui présentent plusieurs intérêts : (i) AvrLm4-7 induit une reconnaissance par les génotypes de colza possédant Rlm4 ou Rlm7 accompagnée, dans certains cas, de phénotypes atypiques ; (ii) Rlm7, combiné ou non à Rlm3, a conservé une efficacité au champ pendant plus de dix ans malgré une utilisation intensive (Balesdent et al., 2022) et RlmS, récemment introduit au champ, présente également pour le moment une bonne efficacité ; (iii) AvrLm4-7 est fortement impliqué dans l'agressivité de L. maculans et sa fitness' (Huang et al., 2006 ; Nováková et al., 2016); (iv) AvrLm3, AvLm5-9 et AvrLmS-Lep2 sont (presque) toujours présents dans les isolats naturels de L. maculans (Gautier et al., 2023), suggérant une forte implication de ces protéines dans la fitness' de L. maculans ; (v) de nombreuses données génotypiques et phénotypiques sont disponibles pour l'ensemble des interactions (Daverdin et al., 2012 ; Plissonneau et al., 2017 ; Balesdent et al., 2022 ; Gautier et al., 2023) ; (vi) les protéines de résistance Rlm4, Rlm7, Rlm9 (et potentiellement Rlm3) sont des formes alléliques de la même protéine R membranaire correspondant à une Wall-Associated Kinase-Like (WAKL ; Larkan et al. 2019 ; Haddadi et al., 2022).
Le projet de thèse sera organisé en trois tâches visant à caractériser structuralement et fonctionnellement les interactions R / AVR au sein de la famille LARS (Tâche 1), à explorer plus spécifiquement la capacité d'AvrLm4-7 à supprimer l'ETI (Tâche 2) et à déterminer l'implication des effecteurs AVR de la famille LARS dans le processus infectieux de L. maculans (Tâche 3).

Tâche 1 - Caractérisation structurale et fonctionnelle des interactions R / AVR au sein de la famille LARS
1.1Analyse des mécanismes permettant d'échapper à la reconnaissance par les protéines de résistance
L'équipe EPLM dispose de nombreuses données de séquence des gènes AvrLm issues de campagnes de collectes régulières dans les populations françaises de L. maculans et de suivi du contournement de Rlm7 et Rlm3 (Plissonneau et al., 2017 ; Balesdent et al., 2022). Plus récemment, l'équipement EPLM a suivi les premiers événements de contournement de RlmS grâce à un phénotypage de ces souches sur des variétés de colza différant dans leur contenu en gènes de résistance (Balesdent et al., 2022 ; Gautier et al., 2023 ; Gautier et al., en prep.). A son arrivée, le.la doctorant.e travaillera sur la base de données générée pour en extraire les informations concernant les allèles d'AvrLmS-Lep2, AvrLm4-7 et AvrLm3 afin d'explorer les mécanismes de contournement des résistances correspondantes. Les différents sites polymorphes identifiés seront localisés sur les structures 3D des effecteurs. Les nouveaux allèles de virulence identifiés seront validés par remplacement au locus chez une souche avirulente de L. maculans, ou, dans le cas d'AvrLm4-7 et d'AvrLm3, par expression transitoire avec Rlm7 ou Rlm3 dans Nicotiana benthamiana et par mesure quantitative de la HR induite (cf. protocole de Ma et al., 2012). Si les phénotypes de virulence ne sont pas associés à un polymorphisme de séquence dans le gène AVR, le niveau et la cinétique d'expression du gène seront étudiés ainsi que la séquence de la région promotrice. Enfin, si le phénotype de virulence n'est pas lié au locus AVR lui-même, l'implication d'un autre gène sera recherchée par un croisement génétique entre souche virulente et avirulente, phénotypage des descendants sur une variété de colza résistance et séquençage en bulk des descendants virulents et avirulents.
1.2Caractérisation moléculaire des phénotypes atypiques
L'équipe EPLM a identifié, lors de ses collectes en France, 25 souches de L. maculans qui, quand elles sont inoculées sur le même génotype de colza possédant Rlm7, induisent des phénotypes atypiques. Le.a doctorant.e caractérisera finement les symptômes obtenus sur génotypes portant la résistance Rlm7 et explorera la diversité génétique au locus AvrLm4-7 dans ces souches. Si un polymorphisme de séquence est observé, les allèles correspondants seront clonés et introduits dans une souche de L. maculans virulente vis-à-vis de Rlm7, afin de valider si ces allèles sont bien impliqués dans un phénotype atypique. Pour les souches où aucun polymorphisme de séquence ne serait observé, la cinétique d'expression d'AvrLm4-7 sera suivi au cours de l'infection et la séquence promotrice d'AvrLm4-7 dans ces souches sera analysée.

Tâche 2 : Compréhension structurale et fonctionnelle de la capacité d'AvrLm4-7 à supprimer l'immunité végétale :
2.1Détermination des types de morts cellulaires et des voies de défense supprimées en présence d'AvrLm4-7 :
Afin de déterminer la capacité d'AvrLm4-7 à supprimer l'ETI, et plus généralement la mort cellulaire, AvrLm4-7 sera co-exprimé de façon transitoire dans N. benthamiana, à l'aide d'A. tumefaciens, avec des inducteurs de la PTI (e.g. élicitine INF1) ou de l'ETI (AvrPto, couples Avr4 / Cf4 ou AvrLm3 / Rlm3). Des premières expériences avaient montré une capacité d'AvrLm4-7 à supprimer la mort cellulaire induite par BAX (Blondeau et al., 2015). En parallèle, des tests pathologiques seront réalisés sur une variété de colza possédant Rlm3 en présence d'une souche de L. maculans exprimant AvrLm3 seul ou AvrLm3 et AvrLm4-7 et des analyses RNAseq seront réalisées à 2 temps d'infection précoce (4 et 7 jours après infection (jpi)) afin de comparer les voies de signalisation induites ou réprimées selon la présence ou non d'AvrLm4-7.
2.2Détermination des régions protéiques impliquées dans la suppression de l'ETI :
A partir des données générées dans la tâche 1 et de précédents travaux de l'équipe EPLM, ainsi que de la connaissance de la structure 3D d'AvrLm4-7, des sites polymorphes et des régions protéiques potentiellement impliquées dans la capacité d'AvrLm4-7 à masquer la reconnaissance d'AvrLm3 seront identifiés. Une analyse structure - fonction sera réalisée en synthétisant différents variants d'AvrLm4-7 qui seront testés par expression transitoire dans N. benthamiana, en mesurant la capacité de ces variants à induire une HR en présence de Rlm7 et à supprimer la reconnaissance d'AvrLm3 par Rlm3. Pour les phénotypes les plus contrastés, une complémentation dans une souche de L. maculans virulente vis-à-vis de Rlm7 et avirulente vis-à-vis de Rlm3 sera réalisée.

Tâche 3 : Implication des effecteurs de la famille LARS dans le processus infectieux de L. maculans
3.1 Implication des effecteur AVR de la famille LARS dans la pathogénie de L. maculans : Seul AvrLm4-7 est parfois délété dans les souches naturelles de L. maculans. Des souches complémentées par AvrLm4-7 ou inactivées pour AvrLm3, AvrLm5-9 ou AvrLmS-Lep2 (inactivation ciblée par la technique CRISPR-Cas9 ; Idnurm et al., 2017) seront utilisés. Des souches naturelles présentant une délétion au locus Avrlm4-7 complémentées avec un allèle avirulent d'AvrLm4-7 et des transformants inactivés pour AvrLm5-9 sont déjà disponibles. L'inactivation d'AvrLm3 et d'AvrLmS-Lep2 par CRISPR-Cas9 sera initiée avant le début de la thèse. Les différents transformants et les souches parentales correspondantes seront évalués pour leur capacité à causer des nécroses sur cotylédons et tiges de colza sensible, ainsi que pour leur capacité de croissance et de sporulation.
3.2 Identification des processus cellulaires ciblés par les effecteurs LARS :
Les transformants générés dans la tâche 3.1 seront utilisés pour infecter une variété de colza sensible, dont le génome est disponible, et réaliser des analyses RNAseq à deux temps précoces d'infection (à 4 et 7 jpi, en phase asymptomatique de l'infection) afin de déterminer les processus végétaux différentiellement induits en présence ou absence des effecteurs LARS AvrLm4-7, AvrLm3, AvrLm5-9 et AvrLmS-Lep2. Si des processus cellulaires modulés par ces effecteurs sont identifiés, des analyses complémentaires pourront être mise en place (dosages hormonaux, analyses protéomiques ou métabolomiques).