Thèse Étude Fonctionnelle et Structurale du Mécanisme de Résistance à l'Argent Ag+ chez les Bactéries Gram-Négatives H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health École doctorale : Signalisations et Réseaux Intégratifs en Biologie Laboratoire de recherche : I2BC - Institut de Biologie Intégrative de la Cellule Direction de la thèse : Guillaume LENOIR ORCID 0000000287595179 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-05T23:59:59 La résistance au antimicrobiens est en passe de devenir, dans les prochaines décennies, la cause principale de décès dans le monde. On estime à l'heure actuelle qu'à l'horizon 2050, 10 millions de morts seront attribuées à la résistance aux antimicrobiens. Dans ce contexte, l'utilisation des métaux comme antimicrobiens reçoit une attention grandissante, notamment en raison de l'échec des approches de chimie médicinale organique traditionnelles. Parmi ces métaux, l'argent (Ag+) est celui le plus intimement lié à l'activité antimicrobienne, et par ailleurs le plus utilisé pour combattre les infections microbiennes. Inévitablement, les bactéries ont développé des mécanismes de résistance à l'Ag+ pour contrer l'effet toxique des substances bactéricides, En particulier, les bactéries Gram-négatives ont développé un système d'efflux basé sur le transport actif d'Ag+ du cytosol au périplasme, ainsi qu'un mécanisme basé sur la chélation de l'Ag+ par des petites protéines solubles périplasmiques appelées chaperonnes. Ces 2 systèmes permettent respectivement de diminuer la concentration d'Ag+ dans le cytosol et de limiter sa toxicité.
Le système de résistance à l'Ag+ est codé par l'opéron appelé sil, composé de 9 protéines dont une ATPase de type P1B (SilP) qui couple l'hydrolyse d'ATP au transport actif d'ions, et une protéine périplasmique liant l'argent, SilG. Malgré le fait que SilG possède un motif de fixation aux métaux et qu'elle soit prédite pour interagir avec SilP, son rôle reste méconnu. Par ailleurs, l'activité de SilP n'a à ce jour pas été étudiée in vitro, l'ion qu'elle transporte n'a pas été identifié et le mécanisme de transport n'a pas été élucidé.
Ce projet de thèse a pour but de combler ce manque de connaissance du mécanisme moléculaire sous-jacent à l'efflux d'Ag+ à travers la membrane cytoplasmique bactérienne. Dans cette optique, le (la) doctorant.e sera dans un premier temps en charge de l'optimisation de l'expression de la protéine SilP dans la bactérie E. coli, et de sa purification. L'obtention d'un échantillon de SilP purifié permettra de mesurer son activité d'hydrolyse de l'ATP, et de donner de premières indications quant au métal transporté. Les preuves de ce transport seront apportées après reconstitution de SilP en protéoliposomes et mise au point d'un test de transport. Enfin, ces données fonctionnelles seront complétées par l'étude structurale de SilP par cryo-microscopie électronique, afin d'obtenir une vision complète et détaillée du mécanisme moléculaire de transport de l'Ag+ par SilP. L'influence de SilG sur l'activité de SilP sera déterminée, ainsi que la structure du complexe SilG-SilP.
Une meilleure compréhension du système sil doit permettre de contribuer à de nouvelles initiatives de santé publique.
Les propriétés antibactériennes des ions argent (Ag+) sont connues depuis des siècles. Du temps des Grecs anciens, l'argent était déjà utilisé pour soulager les maux d'estomac ou soigner les blessures. Actuellement, il est utilisé dans les hôpitaux pour réduire les maladies nosocomiales, dans les systèmes de purification de l'eau, les piscines ou encore les systèmes d'approvisionnement en eau potable (Barras et al, 2018). Les propriétés antibactériennes de l'Ag+ Ont des origines diverses. L'Ag+ peut d'une part se lier à l'ADN, provoquer sa condensation et perturber sa transcription. L'Ag+ peut également se lier aux groupements sulfhydriles portés par les cystéines, et ainsi se substituer à d'autres métaux présents dans les métalloenzymes, perturbant leur activité. Enfin, l'Ag+ conduit à une augmentation de la perméabilité cellulaire.
En plus de leur propriété antibactérienne directe, les ions Ag+ potentialisent l'activité bactéricide des antibiotiques, en particulier des aminoglycosides comme la gentamicine, la kanamycine ou la streptomycine. Les effets potentialisateurs de l'Ag+ sont observés à la fois sur des cultures de bactéries en laboratoire et sur des modèles animaux. Les ions Ag+ sont donc également utilisés comme adjuvants aux antibiotiques. Le mécanisme moléculaire par lequel l'argent renforce la toxicité des aminoglycosides n'est pas entièrement clair, mais semble lié à la capacité de l'Ag+ à augmenter la perméabilité des membranes.
Pour contrer l'effet toxique des substances bactéricides, incluant les ions Ag+, les bactéries ont développé des mécanismes de résistance. Les mécanismes de résistance peuvent être divisés en trois groupes principaux : (i) la protection d'une cible moléculaire contre l'action d'un bactéricide par modification ou remplacement de celle-ci, (ii) une diminution de la concentration de la substance toxique dans l'espace cytoplasmique due à des modifications de la structure de la paroi cellulaire ou de la membrane, ainsi qu'à l'apparition d'une voie nouvelle d'efflux de la substance toxique, (iii) l'inactivation de la substance bactéricide via la formation d'une forme moins toxique.
Pour ce qui est de la résistance à l'argent, les bactéries, notamment Gram-négatives, ont développé un système d'efflux basé sur le transport actif d'Ag+ du cytosol au périplasme, ainsi qu'un mécanisme basé sur la chélation de l'Ag+ par des petites protéines solubles périplasmiques. Ces 2 systèmes permettent respectivement de diminuer la concentration d'Ag+ dans le cytosol et de limiter sa toxicité.
Le système de résistance à l'Ag+ est codé par l'opéron appelé sil, composé de 9 protéines : une pompe d'efflux Ag+/H+ tripartite (SilABC), une ATPase de type P (SilP) qui couple l'hydrolyse d'ATP au transport actif de métaux, un système de régulation à deux composants (SilRS) et trois protéines périplasmiques liant l'argent SilE, SilG et SilF (Figure 1A). La protéine SilG est la protéine de l'opéron sil identifiée le plus récemment et, malgré le fait que SilG possède un motif de fixation aux métaux et qu'elle soit prédite pour interagir avec SilP (Figure 1A-B), son rôle reste méconnu.
La protéine SilP appartient à la sous-famille P1B des ATPases de type P (ATPases-P1B), sous-famille spécialisée dans le transport des métaux à travers les membranes cellulaires. Ces transporteurs jouent un rôle essentiel dans l'homéostasie des métaux, que ce soit pour la détoxification des cellules ou la distribution intracellulaire des métaux essentiels. Les ATPases-P1B sont formées de 3 domaines cytosoliques impliqués dans l'hydrolyse de l'ATP : le domaine N qui fixe l'ATP, le domaine P phosphorylé au cours du cycle de transport et le domaine A qui catalyse la déphosphorylation du domaine P (Figure 1B). Par ailleurs, la spécificité des ATPases-P1B réside dans le fait qu'elles possèdent des domaines de fixation des métaux (MBD) au niveau de leurs extrémités N- et C-terminales. Le nombre et rôle exact de ces domaines MBD pour SilP reste cependant énigmatique (Figure 1B). Plus généralement, l'identité du ou des ions transportés par SilP reste à établir.
Les structures tridimensionnelles des composants transmembranaires de l'opéron sil, notamment de la protéine SilP, n'ont pas été déterminées, et les propriétés fonctionnelles de SilP n'ont pas non plus été étudié in vitro. Cela empêche une compréhension fine des mécanismes sous-jacents à la résistance à l'argent chez les bactéries Gram-négatives. Notre objectif est d'obtenir une vision détaillée du transport d'Ag+ par SilP et d'étudier le rôle de l'interaction entre SilP et SilG dans ce transport. Ce travail réalisé sur le système sil pourra trouver des applications dans la lutte contre les bactéries Gram-négatives pathogènes.
SilP est une protéine transmembranaire de la famille des ATPases de type P1B, des transporteurs actifs spécialisés dans le transport de métaux et présents dans tous les règnes du vivant. Cette activité est cruciale, d'une part pour la détoxification de certains métaux en excès (Ag+, Cd2+, Pb2+), mais également pour l'approvisionnement de certains compartiments cellulaires et des métalloenzymes en métaux physiologiques. SilP est une protéine codée par l'opéron Sil, identifié sur le plasmide pMG101. Cet opéron confère la résistance à l'argent (Ag+) à une souche de Salmonella enterica, un métal communément utilisé pour ses effets bactéricides.
L'appartenance de SilP à la famille des ATPases de type P1B suggère que cette dernière est impliquée dans l'export de l'argent du cytoplasme vers le périplasme des bactéries. À ce jour, et malgré l'importance de la résistance à l'argent en santé humaine, le mécanisme du transport de l'argent dans les bactéries Gram-négatives reste énigmatique. Cela est dû en particulier à l'absence de données structurales à haute résolution pour la protéine SilP. Par ailleurs, la compréhension du mécanisme de transport, au niveau moléculaire, nécessite une étude fonctionnelle détaillée de l'activité de SilP. Ce projet de thèse a pour but d'élucider le mécanisme, d'un point de vue fonctionnel et structural, de transport des ions Ag+ par la protéine SilP. Une meilleure compréhension de ce système doit permettre de fournir des informations cruciales pouvant contribuer à de nouvelles initiatives de santé publique et à la découverte future de médicaments. Spécifiquement, les objectifs principaux de cette thèse sont les suivants :

i. Optimiser la sur-expression et la purification du transporteur SilP.
ii. Caractériser l'activité du transporteur SilP purifié, en détergent ou après reconstitution dans des systèmes membranaires mimétiques (nanodisques et protéoliposomes).
iii. Déterminer la structure tridimensionnelle de SilP par cryo-microscopie électronique (cryo-EM)
iv. Étudier l'interaction de SilP avec SilG, une protéine périplasmique qui fixe l'argent.
Mutagenèse dirigée, biochimie des protéines membranaires (expression de protéines recombinantes, solubilisation en détergent, purification, reconstitution en protéoliposomes et en nanodisques), spectrophotométrie (activité d'hydrolyse de l'ATP), phosphorylations à l'aide traceurs radioactifs ([-32P]ATP), fluorescence (intrinsèque et extrinsèque), interactions protéine-protéine (pull-down, chromatographie d'exclusion de taille, tests de flottaison, approches biophysiques : Bio-Layer Interferometry, Micro-Scale Thermophoresis), cryo-microscopie électronique (congélation de grilles, traitement de données, construction de modèles moléculaires).

La personne recrutée dans le cadre de cette thèse possèdera des compétences en biochimie des protéines. Un intérêt particulier pour l'étude des protéines membranaires serait un plus. L'étudiant.e peut être amené.e à évoluer dans un environnement international et devra donc être en mesure de s'exprimer en anglais. Un esprit d'équipe et un grand dynamisme seront des atouts majeurs.