Thèse Caractérisation des Activités Moléculaires de Rad51-Brca2 et Rad52 dans la Prise en Charge des Intermédiaires Hybrides Adn-Arn Lors du Stress Réplicatif H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health École doctorale : Cancérologie : Biologie - Médecine - Santé Laboratoire de recherche : Intégrité du Génome et Cancers Direction de la thèse : Pauline DUPAIGNE ORCID 0000000170334055 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-01T23:59:59 La recombinaison homologue (RH) constitue une voie majeure de réparation des cassures double brin de l'ADN et de maintien de l'intégrité des fourches de réplication en conditions de stress réplicatif. De plus en plus de travaux montrent que l'ARN peut contribuer à la RH non seulement comme élément régulateur, mais aussi comme intermédiaire actif via la formation d'hybrides ADN-ARN, appelés R-loops. Bien que les R-loops se forment physiologiquement au cours de la transcription et participent à la régulation génique, leur accumulation non contrôlée représente une source majeure de stress réplicatif et d'instabilité génomique.
Une accumulation aberrante de R-loops est fortement associée à la tumorigenèse. Plusieurs facteurs de la RH associés au cancer jouent un rôle essentiel dans la prévention ou la résolution des R-loops pathologiques. BRCA1 et BRCA2 limitent l'accumulation excessive d'hybrides ADN-ARN ; la perte de l'un ou l'autre de ces facteurs entraîne une augmentation des niveaux de R-loops, des conflits transcription-réplication accrus et une instabilité génomique. RAD51 et RAD52 ont également été impliqués dans la régulation des hybrides ADN-ARN dans certains contextes. Toutefois, les mécanismes moléculaires précis par lesquels ces facteurs de la RH contrôlent les intermédiaires de réplication et de recombinaison associés aux R-loops restent mal compris.
Un atout majeur du laboratoire d'accueil réside dans son expertise en microscopie électronique (ME), permettant de visualiser et de caractériser directement des structures nucléiques extraites de cellules dans des conditions définies, ainsi que des complexes ADN-protéines et ARN-protéines reconstitués in vitro. Cette approche permet l'analyse structurale directe des intermédiaires de réplication et de recombinaison et s'étend naturellement à des études structurales à haute résolution par cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Dans ce projet, nous exploiterons ces méthodologies afin d'analyser des intermédiaires de réplication et des intermédiaires associés aux hybrides ADN-ARN isolés à partir de cellules cancéreuses, notamment des lignées de cancer de l'ovaire, ainsi que de cellules soumises à des traitements favorisant l'accumulation de R-loops. D'autre part, nous tenterons de reconstituer in vitro les complexes contenant RAD51 ou RAD52 assemblés sur des substrats ADN-ARN, dans des réactions de RH.
Ces approches avancées de microscopie seront associées à des analyses cellulaires et biochimiques complémentaires. Des techniques classiques de biologie cellulaire, telles que l'immunofluorescence (IF) et les essais de ligation de proximité (PLA), permettront de suivre la dynamique spatio-temporelle des R-loops et l'influence des facteurs de la RH. Des analyses biochimiques, telles que les gels retard (EMSA) et des tests in vitro de formation et de résolution des R-loops, permettront de disséquer les interactions médiées par RAD51, RAD52 et BRCA2 avec des substrats ADN-ARN.
Le projet sera structuré autour de trois objectifs principaux :
1. Caractériser par microscopie électronique (ME) la structure des intermédiaires de réplication et des hybrides ADN-ARN en conditions de stress réplicatif.
2. Définir les rôles moléculaires de RAD52, RAD51 et BRCA2 dans la régulation des intermédiaires de réplication et de recombinaison associés aux R-loops.
3. Déterminer les bases structurales des complexes contenant RAD51 ou RAD52 assemblés sur des substrats ADN-ARN. Homologous recombination (HR) is a key pathway for repairing DNA double-strand breaks and preserving replication fork integrity under stress. Recent evidence indicates that RNA molecules participate in HR not only as regulatory scaffolds but also as direct intermediates through the formation of DNA-RNA hybrids, or R-loops. While R-loops naturally arise during transcription and can regulate gene expression, their unscheduled accumulation causes replication stress and genome instability. Aberrant R-loop accumulation is strongly linked to cancer, and several HR factors, including BRCA1, BRCA2, RAD51, and RAD52, play critical roles in preventing or resolving these structures. However, the precise molecular mechanisms by which these proteins regulate R-loop-associated replication and recombination intermediates remain poorly understood, highlighting the need for integrated cellular, biochemical, and structural studies. 1. Characterizing by electron microscopy (EM) the structure of DNA replication intermediates and DNA-RNA hybrids at replication forks under stress conditions.
- Detect and visualize R-loops and stalled or slowed replication forks in various cell lines, including ovarian cancer cells.
- Assess the impact of treatments that promote R-loop accumulation (e.g., RNase H inhibition, chemical replication stress, transcriptional hyperactivation) on DNA replication intermediates.
- Monitor the spatio-temporal dynamics of R-loops and HR factors using immunofluorescence (IF) and proximity ligation assays (PLA).
2. Defining the molecular roles of RAD52, RAD51, and BRCA2 in processing R-loop-associated replication and recombination intermediates.
- Examine the effects of RAD51, RAD52, or BRCA2 inhibition or depletion on replication structures and recombination intermediates.
- Design and calibrate biochemical assays to mimick R-loop formation and resolution (EMSA, in vitro R-loop formation and resolution assays)
- Use EM to characterize RAD51 and RAD52 binding to RNA-DNA hybrids
3. Determine the structural basis of RAD51- and RAD52-containing complexes associated with DNA-RNA hybrids
- Reconstitute and characterize the structure by Cryo-EM of RAD51 and RAD52 complexes on RNA substrates.
- Reconstitute and characterize the structure by Cryo-EM of RAD51 and RAD52 complexes on RNA-DNA R-loops.
- Identify specific RNA-binding motifs of RAD51 and RAD52.
1. Cellular Approaches
- Cell lines: Ovarian cancer cells and other cell types subjected to treatments promoting R-loop accumulation (e.g., RNase H inhibition, hydroxyurea, transcriptional hyperactivation).
- Immunofluorescence (IF): To visualize R-loops and HR factor localization at replication forks.
- Proximity Ligation Assay (PLA): To detect and quantify in situ interactions between HR factors (RAD51, RAD52, BRCA2) and DNA-RNA hybrids.
- iPOND (isolation of proteins on nascent DNA): To monitor proteins associated with replication forks under stress.
2. Experimental Design Considerations
- Compare untreated vs. treated cells to evaluate R-loop accumulation and HR factor recruitment.
- Manipulate HR factors individually or in combination (e.g., knockdown, overexpression) to dissect their contributions.
- Integrate data across methods to link molecular interactions, structural organization, and replication fork behavior.
3. Biochemical Approaches (RAD51, RAD52 and BRCA2 purification have previously been performed in the lab)
- Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA): To test RAD51/RAD52 binding to DNA-RNA substrates.
- In vitro R-loop formation and resolution assays: To measure how HR factors stabilize, remodel, or resolve DNA-RNA hybrids.
4. Structural Approaches
- Electron Microscopy (EM): Direct visualization of in vitro nucleic acid intermediates and protein-DNA-RNA complexes.
- Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM): High-resolution structural characterization of RAD51- and RAD52-containing complexes bound to DNA-RNA hybrids.

Profil
- Étudiant(e) en biologie, biochimie ou discipline similaire, motivé(e) pour la recherche.
- Intérêt pour les mécanismes du métabolisme de l'ADN, la réplication et la recombinaison homologue.
- Capacité à travailler en équipe tout en étant autonome.
- Intérêt pour la biochimie et les aspects moléculaires
- Intérêt pour la microscopie électronique et la cryo-EM et envie d'apprendre ces techniques

Compétences
- Connaissances en biologie moléculaire et biochimie : ADN, réplication, recombinaison.
- Pratique de techniques de laboratoire : PCR, clonage, purification d'ADN/protéines, cultures cellulaires.
- Capacité à analyser et interpréter des données expérimentales.
- Rigueur, organisation et motivation pour les expériences.
- Bonne communication et curiosité scientifique.