Thèse Microcompartiments Bactériens Usines Métaboliques pour la Fermentation de la Lignocellulose en Alcools H/F - 75

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health
École doctorale : Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
Laboratoire de recherche : Génomique métabolique - DRF/JACOB/Génoscope
Direction de la thèse : Andrew TOLONEN ORCID 0000000159074504
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-03-23T23:59:59

La transition énergétique nécessite le développement de procédés biologiques capables de produire durablement des carburants et des molécules d'intérêt à partir de ressources renouvelables. Clostridium phytofermentans est une bactérie anaérobie présentant des adaptations uniques lui permettant de fermenter la lignocellulose en composés biochimiques à haute valeur ajoutée, tels que des alcools. Lors de la fermentation lignocellulosique, C. phytofermentans produit des organites appelés microcompartiments bactériens (BMCs) qui concentrent les enzymes et protègent la cellule des composés toxiques comme les aldéhydes. Ce projet utilise des techniques de pointe en microbiologie, génétique moléculaire, biochimie enzymatique et microscopie pour étudier le rôle des BMCs, véritables nanoréacteurs protéiques intracellulaires, dans la fermentation lignocellulosique. L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle métabolique des BMC chez C. phytofermentans et comment les protéines sont localisées dans les BMC. À terme, notre objectif est de développer des BMCs comme bio-usines modulables pour la production efficace de biocarburants et de molécules à haute valeur ajoutée, contribuant à la transition énergétique et à l'économie circulaire.

La lignocellulose est un substrat récalcitrant et sa structure complexe la rend difficilement accessible aux micro-organismes. Clostridium phytofermentans, une bactérie anaérobie isolée du sol forestier, constitue un modèle unique pour la fermentation de la lignocellulose, grâce à son arsenal de près de 200 enzymes glucidiques actives (CAZymes) capables de dépolymériser les polysaccharides lignocellulosiques et de convertir les sucres libérés en éthanol comme produit principal. Le génome de C. phytofermentans code pour 6 alcool déshydrogénases différentes (ADH). Les ADHs sont des enzymes qui catalysent la réduction des aldéhydes en éthanol et autres alcools. Trois de ces ADHs sont des protéines cytoplasmiques, dont deux figurent parmi les protéines les plus fortement exprimées dans la cellule en présence du glucose et de tous les autres sucres testés. Les 3 autres ADHs ne sont pas exprimées en présence du glucose, et les gènes codant ces ADHs sont localisés dans des clusters qui codent des micro-compartiments bactériens (BMC). Par une approche multidisciplinaire alliant microbiologie, biochimie, imagerie, biologie de synthèse et ingénierie métabolique, ce projet de thèse vise à étudier les BMC en tant que véritables bio-nanomachines qui pourraient convertir efficacement la biomasse lignocellulosique en produits renouvelables.

Ce projet a 4 objectifs principaux:
1. Identifier les conditions d'expression et d'activation des BMCs : via des analyses transcriptomiques (RNA-seq) et métabolomiques pour relier l'expression des gènes codants les BMCs à l'activité métabolique.
2. Démontrer expérimentalement quels ADHs sont exprimés à l'intérieur des BMC. Les protéines ADH seront fusionnées à des marqueurs FAST (Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tags) permettant de visualiser leur localisation cellulaire par microscopie confocale. Si cette méthode ne permet pas d'obtenir une résolution suffisamment élevée, les ADH seront marquées avec un marqueur FLAG, immuno-marquées avec un anticorps marqué à l'or, et les cellules seront visualisées par microscopie électronique.
3. Valider le rôle des ADH associés aux BMC dans la production d'alcool. Les gènes codant les 3 ADHs localisés dans les îlots de gènes BMC seront inactivés à l'aide de CRISPR et les profils de croissance et de fermentation des souches mutantes seront quantifiés par HPLC. Les données de fermentation permettront d'élucider la contribution relative des différents ADH dans le métabolisme du carbone chez cette bactérie.
4. Reprogrammer les BMCs par biologie synthétique: intégration de nouvelles enzymes ou modulation de leur expression via CRISPRi pour rediriger les flux métaboliques vers la production ciblée de bioalcools.

Dans la première partie de ce projet, nous cultiverons la bactérie dans des conditions anaérobies. L'ARN sera extrait des cellules et quantifié par qRT-PCR et RNA-seq. Ces données révéleront les conditions physiologiques dans lesquelles les microcompartiments bactériens (BMC) et les alcool déshydrogénases (ADH) sont exprimés dans C. phytofermentans. Dans la deuxième partie de ce projet, nous produirons des protéines ADH fusionnées à des tags fluorescentes et FLAG. La localisation cellulaire des protéines ADH sera visualisée par microscopie. Dans la troisième partie de ce projet, les gènes codant les ADH seront supprimés et les protéines étrangères seront localisées dans BMCs par les methodes de CRISPR.