Thèse Déterminants Épigénétiques de la Redifférenciassions des Tumeurs Thyroïdiennes H/F - 75

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health
École doctorale : Cancérologie : Biologie - Médecine - Santé
Laboratoire de recherche : Prédicteurs moléculaires et nouvelles cibles en oncologie
Direction de la thèse : Iñigo LANDA ORCID 0000000228178295
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-03T23:59:59

Le cancer différencié de la thyroïde (DTC) constitue un bon modèle pour décrypter les complexités du reprogrammation tumorale et de la différenciation. La thérapie par radioiode (RAI) est le traitement radio-isotopique le plus largement utilisé, employé comme traitement adjuvant et permettant de guérir 30 % des maladies métastatiques. Elle repose sur la capacité des cellules folliculaires thyroïdiennes à capturer l'iode via leur symporteur sodium-iode (NIS). Cependant, l'expression du NIS est souvent diminuée dans le DTC en réponse à des activateurs oncogéniques de la voie de signalisation MAPK, rendant ainsi les deux tiers des patients « réfractaires au radioiode » (RAIR).
Les stratégies dites de redifférenciation consistent en un traitement de courte durée avec des inhibiteurs de MAPK afin de restaurer une expression suffisante de NIS dans les tumeurs RAIR et de les rendre à nouveau avides de RAI. Cependant, de nombreuses tumeurs restent réfractaires, et il est essentiel d'optimiser les protocoles de redifférenciation. Par ailleurs, nos données préliminaires suggèrent que cette résistance repose principalement sur une reconfiguration épigénétique. Les objectifs globaux de ce projet sont donc d'identifier les déterminants épigénétiques de la redifférenciation thyroïdienne afin de surmonter la résistance à la thérapie par RAI.

Pour ce faire, nous poursuivrons les objectifs suivants :
1.Identifier les biomarqueurs épigénétiques des cancers thyroïdiens RAIR par un profilage intégré des transcriptomes tumoraux, de l'accessibilité et des marques de la chromatine, ainsi que de la méthylation de l'ADN sur des échantillons tumoraux appariés.
2.Disséquer les mécanismes de résistance au RAI et à l'inhibition de MAPK en établissant des organoïdes dérivés de patients (PDOs) à partir d'échantillons tumoraux thyroïdiens et en perturbant des cibles épigénétiques spécifiques.

Dans l'objectif 1, nous collecterons prospectivement des échantillons thyroïdiens de patients inclus dans des stratégies de redifférenciation. Une biopsie tumorale sera prélevée à la fois avant le traitement de redifférenciation et après l'administration d'inhibiteurs de MAPK. Notre cohorte de DTC RAIR sera enrichie par la collecte d'échantillons de patients réfractaires qui ne sont pas inclus dans les essais de redifférenciation. Nous réaliserons des analyses RNAseq et ATACseq sur les biopsies pré- et post-traitement afin de corréler l'expression génique et l'accessibilité de la chromatine après redifférenciation (ou son absence). Si le matériel le permet, nous effectuerons des analyses CUT&Tag pour les candidats sélectionnés et étudierons la méthylation de l'ADN. Si des biomarqueurs sont identifiés, ils seront validés sur des échantillons congelés et FFPE issus de patients métastatiques bien annotés.
Dans l'objectif 2, nous traiterons un sous-ensemble de biopsies tumorales fraîches afin de générer des PDOs. Ceux-ci seront d'abord caractérisés pour leur capacité de croissance en passages successifs, l'expression et la localisation du NIS, ainsi que les niveaux de différenciation thyroïdienne et les marqueurs d'activation de la voie MAPK. Nous utiliserons ensuite les PDOs pour perturber les principaux déterminants épigénétiques de la RAIR identifiés dans l'objectif 1, via des approches de silençage, surexpression et/ou édition CRISPR de certains facteurs et régions génomiques spécifiques. Parallèlement, nous approfondirons nos recherches sur la dynamique de liaison à la chromatine des complexes NURD, SWI/SNF, PRC2 et CHD4, ainsi que sur leurs marques épigénétiques respectives et leur impact sur la régulation du NIS. De manière transversale, nous évaluerons l'effet des perturbations génétiques et pharmacologiques sur la fixation et la fonctionnalité des facteurs de transcription thyroïdiens.

Tumor reversion strategies that aim at shifting cancer cells to a more differentiated state are promising therapeutic strategies. Differentiated thyroid cancer (DTC) is a good model to decipher the intricacies of tumor reprogramming and differentiation. Radioiodine (RAI) therapy is the most widely used radioisotope therapy, being employed as adjuvant treatment and to cure 30% of metastatic disease. It relies on the ability of thyroid follicular cells to capture iodine via their sodium iodine symporter (NIS). However, NIS expression is often diminished in DTC in response to oncogenic drivers, causing two-thirds of patients to be radioiodine-refractory (RAIR). We know that 90% of DTCs are driven by constitutive activation of the MAPK pathway (via alterations at BRAF, RAS or RET genes) and that these, in turn, repress NIS expression. The former has informed redifferentiation strategies - a tumor reversion strategy used in DTC - by which short-term treatment with MAPK inhibitors can restore sufficient NIS expression on some RAIR tumors and switch them back to a RAI-avid status. However, there is still a great need to determine optimal redifferentiation protocols in DTC patients and, more widely, to inform tumor reprogramming in other cancer lineages.
The overall objectives of this project are to dissect the epigenetic determinants of thyroid redifferentiation to ultimately overcome resistance to RAI therapy. The central hypothesis is that NIS (re-)expression often relies on epigenetic reconfiguration, as suggested by pilot data from our team and others. First, loss-of-function mutations in the SWI/SNF chromatin remodeling complex result in closed chromatin conformations that prevent thyroid-specific transcription factors FOXE1 and PAX8 to facilitate NIS expression, rendering patients insensitive to RAI therapy and unlikely to benefit from redifferentiation trials. Yet, since only 5-10% of DTCs harbor SWI/SNF mutations, without other relevant alterations, there must be non-mutational epigenetic mechanisms preventing thyroid differentiated programs from operating on most RAIR DTCs. Second, preclinical data from Dr. Dupuy's lab highlight the importance of oxidative stress, via NOX4 and reactive oxygen species, in generating DNA damage that elicits transcriptional blockade, impacting NIS expression. This is likely the result of both oxidized 8-oxoguanine nucleotides directly modulating transcription, and also of the recruitment of chromatin remodelers such as members of the NURD repressive complex (e.g., CHD4), which compete for chromatin binding with SWI/SNF. Third, although the specific transcriptional binding sites of the proximal NIS promoter have been mostly deciphered, there is little knowledge on neither its regulation by distal enhancers nor on promoter-enhancer interactions. Overall, the understanding of these biological determinants of thyroid cancer differentiation will likely explain the wide range of responses to RAI therapies that are observed in DTC.

The overall objectives of this proposal are to dissect the epigenetic determinants of thyroid redifferentiation to ultimately overcome resistance to RAI therapy. Our central hypothesis will be tested by pursuing two Specific Aims:
1.Identify the epigenetic biomarkers of RAIR thyroid cancers, by an integrated profiling of tumor transcriptomes, chromatin accessibility and marks, and DNA methylation on paired tumor samples.
2.Dissect the mechanisms of resistance to RAI and to MAPK inhibition by establishing patient-derived organoids (PDOs) from thyroid tumor specimens and perturbing specific epigenetic nodes.

Objectif 1 : Identifier les biomarqueurs épigénétiques des cancers thyroïdiens RAI-R
Work package 1.1. Collecte d'échantillons chez les patients atteints de cancer de la thyroïde.
Nous collecterons prospectivement des spécimens thyroïdiens chez des patients inclus dans un essai de redifférenciation. Nous nous appuierons sur l'étude MERAIODE 2 (Investigateur principal : Livia Lamartina ; PHRC-K26-023) : un essai de redifférenciation ciblant des patients atteints de DTC métastatiques, progressifs et réfractaires porteurs d'une mutation BRAF, qui seront traités pendant six semaines avec le nouvel inhibiteur de BRAF, Plixorafenib. L'inclusion prévue pour l'étude MERAIODE 2 est de 20 patients, dont ceux pris en charge à Gustave Roussy et au sein du réseau ENDOCAN-TUTHYREF (TUmeurs de la THYroïde REFractaires) labellisé par l'InCa, coordonné par Gustave Roussy.
Les critères clés d'inclusion dans MERAIODE 2 sont : DTC histologiquement confirmé ; Mutation BRAFV600E confirmée par séquençage de nouvelle génération (NGS) ; Patient âgé de 18 ans, ayant signé le consentement éclairé ; Maladie réfractaire au RAI définie par la présence d'au moins une tumeur métastatique n'absorbant pas l'iode radioactif, ou progression dans les 12 mois suivant le traitement malgré une captation du RAI ; Présence de cibles mesurables selon RECIST et progression RECIST sur une période de 18 mois ; Indication d'un traitement systémique validée par une RCP locale du réseau ENDOCAN-TUTHYREF.
À noter : pour la recherche translationnelle proposée ici, le focus sur les DTC mutés BRAF est justifié par leur tendance connue à être plus réfractaires que les lésions mutées RAS, et fournira un contexte homogène pour nos expérimentations.
Les protocoles et financements pour la collecte des échantillons sont déjà en place et soutenus par d'autres moyens. Une biopsie, généralement à partir de sites métastatiques (ganglions cervicaux ou poumons), sera réalisée à l'inclusion, avant la thérapie de redifférenciation, puis après six semaines de traitement par inhibiteur de BRAF, ainsi qu'en cas de progression post-traitement. Les biopsies seront cryoconservées et/ou fractionnées et traitées selon les protocoles standards pour les applications prévues. La collecte reposera sur l'expertise clinique existante de nos collègues en oncologie endocrinienne à Gustave Roussy, qui ont une longue expérience sur ce sujet, incluant des essais randomisés ayant changé les pratiques (ex. ESTIMABL NCT00435851, MERAIODE NCT03244956) (Leboulleux et al. 2023, PMID: 37350119 ; Borget et al. 2015, PMID: 26240230) et des protocoles institutionnels (MATCH-R/STING/UNLOCK) (Vasseur et al. 2024, PMID: 39363320).
Notre cohorte d'échantillons pré- et post-redifférenciation sera enrichie par des DTC RAI-R collectés en un seul temps, montrant une réfractarité aux stratégies de redifférenciation en situation adjuvante. Nous estimons collecter 5 à 10 spécimens issus de l'étude MERABLE (financée via PHRC-K23-148, ouverture prévue sous six mois), représentant des contextes autres que BRAF. Nous avons également accès à une large collection de tumeurs thyroïdiennes congelées et incluses en paraffine à Gustave Roussy, constituant une cohorte rétrospective sur 20 ans avec données clinico-pathologiques complètes, qui servira à la validation finale des biomarqueurs. Au total, nous estimons collecter des échantillons provenant de diverses sources pour environ 50 patients.
Work package 1.2. Caractérisation épigénomique des échantillons.
Les données mutationnelles seront obtenues par NGS de routine (type OncoDeep) sur les tumeurs et métastases. Cela permettra de constituer des groupes biologiquement homogènes (ex. un sous-groupe de DTC RAI-R mutés BRAF devrait présenter des mutations additionnelles dans le promoteur TERT, PIK3CA, etc.) pour les comparaisons ultérieures. Nous réaliserons ensuite un profilage épigénétique complet de ces tumeurs : Séquençage long-read Nanopore (mutations, altérations du nombre de copies, méthylation de l'ADN) ; RNAseq et ATACseq sur biopsies pré- et post-traitement pour corréler expression génique, accessibilité chromatinienne et profils de méthylation après redifférenciation (ou absence de celle-ci) ; Si le matériel le permet, CUT&Tag pour des candidats sélectionnés (ex. CHD4).
La reproductibilité des profils épigénétiques entre tumeurs primaires et organoïdes dérivés (voir Objectif 2) guidera les analyses supplémentaires. Les analyses s'appuieront sur l'expertise et les ressources des programmes STING et EpiCure SIRIC à Gustave Roussy, incluant la plateforme bioinformatique pour l'intégration des données. Les spécimens RAI-R seront particulièrement informatifs et, par définition, mieux représentés que leurs homologues avides de RAI, qui pourront être complétés par des données publiques RNAseq et ATACseq sur les DTC issues du TCGA. Si des biomarqueurs sont identifiés, ils seront validés sur des échantillons archivés congelés et FFPE (ex. immunohistochimie) provenant de patients métastatiques répondant au RAI avec des réponses variables, ainsi que des DTC RAI-R.
Globalement, ces analyses permettront de constituer une population de patients entièrement caractérisée, qui informera deux objectifs ultérieurs : Garantir que les organoïdes (que nous établirons à partir d'un sous-ensemble) reproduisent fidèlement les caractéristiques des spécimens primaires ; Identifier, en plus des candidats ciblés, de nouveaux biomarqueurs que nous pourrons manipuler (génétiquement et pharmacologiquement) dans les PDO pour restaurer l'expression de NIS.

Objectif 2 : Décrypter les mécanismes de résistance au RAI et à l'inhibition de la voie MAPK en établissant des organoïdes dérivés de patients (PDOs)
Work package 2.1. Génération et caractérisation des PDOs.
Nous nous concentrerons d'abord sur l'optimisation des protocoles pour générer des organoïdes thyroïdiens pleinement informatifs et fonctionnels, afin d'éviter un usage inutile du matériel des patients. À cette fin, nous utiliserons des DTC murins issus de modèles de souris génétiquement modifiées du laboratoire du Dr Iñigo Landa (Landa et al. 2023, PMID: 37478162) comme source cohérente et potentiellement illimitée de spécimens tumoraux BrafV600E, présentant des caractéristiques comparables aux échantillons humains d'intérêt. Ces modèles fourniront également des thyrocytes normaux, qui seront comparés directement à leurs homologues tumoraux.
En bref, un protocole typique de génération d'organoïdes comprend la culture primaire de cellules thyroïdiennes dans un milieu à membrane basale réduit en facteurs de croissance, adapté à partir de conditions optimisées pour maintenir la différenciation thyroïdienne (ex. Bravo et al. 2013, PMID: 23539720). Les thyrocytes sont ensuite surveillés pour leur agrégation et prolifération en structures folliculaires avec des lumières homogènes, puis évalués pour l'expression de marqueurs spécifiques de la thyroïde sur plusieurs semaines (par immunofluorescence). Les organoïdes peuvent ensuite être testés pour leur réactivité à la TSH et l'expression basolatérale de NIS. Pour le repiquage, nous testerons plusieurs procédés enzymatiques pour libérer des follicules intacts et des conditions de support (ex. Matrigel en conditions d'ultra-faible adhérence, selon Kühnlenz et al. 2023, PMID: 35536601). Nous optimiserons ces protocoles pour les cellules cancéreuses thyroïdiennes, qui présentent une hétérogénéité accrue et une différenciation réduite. Par exemple, le choix du support ex vivo (Matrigel vs alternatives synthétiques) sera évalué en fonction de la rigidité et de l'invasivité tumorales. Nous intégrerons les recommandations spécifiques des travaux des Drs Costagliola et Romitti sur la création d'organoïdes thyroïdiens normaux et tumoraux (Antonica et al. 2012, PMID: 23051751 ; Lasolle et al. 2024, PMID: 37985676) ainsi que d'autres protocoles publiés (Sondorp et al. 2020, PMID: 33142750 ; Veschi et al. 2023, PMID: 36906579). Les travaux seront réalisés dans le cadre des efforts institutionnels pour générer des PDOs à partir de multiples types de cancers sur la plateforme Organoïdes de Gustave Roussy, dirigée par le Dr Pierre Savagner, qui fournira ressources, expertise et supervision des bonnes pratiques.
Une fois les protocoles optimisés (prévu d'ici la fin de la première année), nous utiliserons systématiquement des échantillons (frais ou cryoconservés) de DTC RAI-R pour la génération de PDOs. Un système d'expédition en place pour les spécimens provenant d'autres centres TUTHYREF maximisera le nombre d'échantillons frais. Les PDOs seront évalués histologiquement et génomiquement sur plusieurs passages et comparés à la caractérisation équivalente de leurs échantillons primaires appariés. Les PDOs établis à partir de tumeurs RAI-R seront ensuite validés pour des paramètres fonctionnels pertinents via des analyses histologiques et moléculaires (ex. expression et localisation correcte de NIS, niveaux de différenciation thyroïdienne et marqueurs de la voie MAPK par RNAseq et western blot). Ils seront ensuite soumis à des approches épigénomiques équivalentes à celles appliquées aux tumeurs primaires pour confirmer leur statut de « jumeaux cliniques ». Seuls les PDOs pleinement informatifs seront utilisés pour les essais ultérieurs.
Work package 2.2. Perturbation des PDOs pour comprendre les déterminants de la résistance au RAI.
Nous utiliserons nos PDOs fonctionnellement caractérisés pour perturber les principaux déterminants épigénétiques de la résistance au RAI, par silencing, surexpression et/ou édition CRISPR de noeuds spécifiques. Nous adopterons une approche en deux volets :
D'une part, nous nous appuierons sur nos facteurs candidats (issus des données pilotes) et suivrons la dynamique de liaison à la chromatine des régulateurs épigénétiques des complexes NURD, SWI/SNF et PRC2 (polycomb repressive 2), ainsi que leurs marques chromatiniennes respectives et leur impact sur la régulation de NIS. Nous émettons l'hypothèse que les rôles répressifs transcriptionnels de NURD-PRC2 antagonisent l'accessibilité chromatinienne médiée par SWI/SNF, et que cet équilibre influence le programme différencié thyroïdien. Fait crucial, des inhibiteurs de l'effecteur PRC2 EZH2 (ex. tazemetostat) sont disponibles et seront évalués dans nos PDOs pour leur capacité à induire des configurations chromatiniennes permissives restaurant la différenciation thyroïdienne. Nous étudierons également les effets du stress oxydatif sur l'ADN, les conformations chromatiniennes, la méthylation et la transcription de NIS, ainsi que les actions médiées par NOX4 sur NURD. Globalement, nous évaluerons l'effet de ces perturbations génétiques et pharmacologiques sur la liaison et la fonctionnalité des facteurs de transcription thyroïdiens (ex. par co-IP ou CUT&RUN).
D'autre part, nous exploiterons notre caractérisation épigénomique des DTC RAI-R primaires pré- et post-redifférenciation pour identifier une liste de nouveaux déterminants de la réfractarité, que nous évaluerons selon une approche similaire à celle décrite pour les facteurs candidats. Enfin, les déterminants validés fonctionnellement (issus des travaux sur PDOs) seront évalués sur du matériel archivistique provenant de patients atteints de DTC RAI-R.